發(fā)布時間：2020-11-02 06:09

　　 目的:細菌附著及生物膜形成是造成種植體相關感染(種植體周圍黏膜炎、種植體周圍炎)的始動因子,生物膜一旦形成則難以清除,且長期持續(xù)存在于種植體表面對種植體-骨組織界面形成的骨結合產生不良影響,繼而增加種植失敗的幾率。此外,口腔種植體貫穿骨組織、軟組織及口腔環(huán)境,種植體-軟組織界面處良好的袖口封閉是保護下方種植體-骨組織界面骨結合的先決條件。當軟組織生物學屏障被破壞時,細菌及致炎因子沿種植體-軟組織界面侵入,破壞種植體骨結合,引起種植體周圍黏膜炎和種植體周圍炎,最終導致種植修復失敗。首先,本課題組以柔性/剛性Linker為媒介連接抗菌肽和鈦結合肽minTBP-1來構建新型融合肽,并用其修飾鈦種植體表面以獲得抑菌功能,從而抑制鈦種植體表面細菌附著和生物膜形成;其次,本實驗選取minTBP-1和能夠促進種植體周圍袖口封閉的功能性多肽LNA3G3P,以Linker相連接構建新型重組融合肽,從而達到促進種植體周圍軟組織封閉的目的。最終,本研究希望通過鈦表面生物功能涂層修飾降低種植體周圍黏膜炎和種植體周圍炎的發(fā)生幾率,為臨床提高種植治療的成功率提供依據。方法:在構建抗菌性融合肽時,將抗菌端(JH8194:KRLFRRWQWRMKKY)和鈦結合端(minTBP-1:RKLPDA)以直接連接及柔性(GGGGS)/剛性(PAPAP)Linker連接的方式構建出3種融合肽,并以合成的多肽修飾鈦金屬表面。通過石英晶體微天平(QCM)、原子力顯微鏡(AFM)以及X射線光電子能譜(XPS)對多肽在金屬鈦表面的吸附學行為進行表征,并通過激光共聚焦顯微鏡(CLSM)對S.gordonii、S.sanguis和P.gingivalis在金屬鈦表面的附著情況進行觀察,探討其抑菌作用。在構建具有促進生物學封閉功能的新型融合肽時,我們在功能性多肽LNA3G3P與minTBP-1之間插入剛性(EAAAK)_4或柔性(GGGGS)_4 Linker,構建了2種融合肽。驗證新型融合肽在鈦表面吸附能力的同時,采用一系列體內、外實驗,探索其促鈦進鈦種植體周圍生物學封閉的效果和內在機制。并通過生物信息學手段闡述不同Linker對融合肽優(yōu)化設計的影響。結果:以Linker連接抗菌端和鈦結合端構建的融合肽表現(xiàn)出較無Linker的融合肽更強的鈦結合性能(p0.05)。對各融合肽在鈦表面的吸附學行為進行方程擬合發(fā)現(xiàn),其隨濃度增加的吸附學行為符合單一Langmiur吸附模型,隨時間變化的吸附學行為符合雙項Langmiur吸附模型,二者均得到了良好的擬合優(yōu)度。另外,與柔性Linker融合肽相比,剛性者顯示出更強的抑菌性能。本研究中構建的促軟組織封閉融合肽,能夠牢固吸附于鈦金屬表面,激活人類口腔上皮細胞(OEC)中整合素α6β4(Integrin-α6β4,In-α6β4)信號通路,啟動半橋粒(HD)的錨定。而該過程同樣受到PI3K信號通路的調控。在促進生物學封閉的融合肽中,具有柔性Linker的融合肽顯示出較剛性Linker融合肽更為有效的生物學功能,這可能與前者擁有更好的自由度從而能夠實現(xiàn)更大范圍的誘導契合有關。結論:以Linker為媒介將抗菌肽和鈦結合肽minTBP-1相結合能夠構建出同時具有抵抗生物膜初期形成菌和結合金屬鈦的雙功能融合肽,從而為抑制種植術后細菌附著和生物膜形成、促進種植體周圍生物學封閉提供了理論支持。同時,本研究也為相關實驗中Linker的選擇和融合肽的設計提供了思路和參考。本研究中的抗菌性融合肽具有廣譜抗菌性能,能夠在種植手術完成初期提供良好的抗菌特性,為種植體周圍黏膜炎和種植體周圍炎的預防和治療提供新思路。而本研究構建的促軟組織封閉新型融合肽,通過加強種植體周圍牙齦軟組織中半橋粒的質和量,起到促進袖口封閉的效果,為種植體周圍界面提供了一道有效的防御屏障。
【學位單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R783.6
【部分圖文】：

天津醫(yī)科大學博士學位論文，既往研究團隊通常采用化學交聯(lián)法將其固定于鈦片表面以形成抗菌過一系列復雜的化學反應，其過程中不免使用某些有毒性的化學試劑到一種簡單、快捷、安全的實驗方法將抗菌肽固定于鈦表面。隨著溶酶體展示技術和細胞表面展示技術的發(fā)展，有研究合成出一類結合肽（genetically engineered peptides for inorganics, GEPIs）[8]。由有特異性和選擇性，故而有望通過無機結合肽將其他功能性基團（do結合肽的靶表面，實現(xiàn)抗菌肽簡單、特異地結合在鈦表面。最近，一機結合肽得到了廣泛認可，名為 minTBP（圖 1）。其與金屬鈦表面具minTBP-1 在 P4 位發(fā)生扭結(kink), 使得 Rl 與 D5 在同一平面上；Rl (Lewis base)和鈦表面的-Ti-O-通過靜電結合; D5 側鏈上的劉易斯酸-OH2+通過靜電結合。所以，在不影響 minTBP-1 與 JH8194 各自功能分別作為無機結合端和抗菌端組成融合肽將是一次有希望的嘗試。

天津醫(yī)科大學博士學位論文傷應答中，HD 發(fā)生解聚。在上皮細胞遷移完成后，HD 會快速重組，實現(xiàn)此過程的動態(tài)調控對傷口愈合至關重要。In-α6β4 可以在配體結合或細胞內的某些過程中被激活，作為 LN-5 的受體參與 HD 的組裝和錨定過程，[25]其與 LN-5 之間的受體配體結合作用是結合上皮錨定于鈦表面的動力來源。因此，增強結合上皮處 HD 的數(shù)量和質量直接關系到結合上皮對鈦種植體或基臺的結合能力。

天津醫(yī)科大學博士學位論文 一、抗菌性融合肽修飾的鈦種植體抑制生物膜形成的研究1 kV、20 mA 條件下，深度剖析（depth analysis）通過在 0 s 到 160 s 氬離子刻蝕條件下完成，每 10s 完成一次刻蝕并采集能譜。所有的結合能通過 C1s 峰(285.0 eV)校對。1.1.4 石英晶體微天平（QCM）檢測
【參考文獻】

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1 張程程;巴亞瑪;張卓然;劉夢園;李紅彩;張玉梅;;鈦種植體表面不同管徑TiO_2納米管涂層與軟組織結合的體內研究[J];牙體牙髓牙周病學雜志;2014年02期

2 馬清泉;單安山;董娜;曹艷萍;;富含亮氨酸和精氨酸的抗菌肽設計[J];畜牧獸醫(yī)學報;2011年06期

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本文編號：2866672