目的：本研究通過抗-EMMPRIN單克隆抗體、基質金屬蛋白酶抑制劑多西環(huán)素、化療藥物順鉑及聯(lián)合應用,觀察其對人舌鱗Tca8113細胞及裸鼠移植瘤的影響,評估其對舌鱗癌抑制作用,從改變腫瘤細胞微環(huán)境的角度初探阻斷腫瘤侵襲的機制。 方法： 一、細胞實驗： 1.細胞培養(yǎng)：細胞復蘇、傳代、凍存。 2.細胞藥物干預,MTT法(四甲基偶氮唑藍法)評價抑制作用：通過加入藥物抗-EMMPRIN單克隆抗體、多西環(huán)素、抗-EMMPRIN單克隆抗體與多西環(huán)素聯(lián)合用藥、抗-EMMPRIN單克隆抗體與順鉑聯(lián)合用藥,觀察其舌鱗癌Tca8113細胞的增殖抑制作用。 二、動物實驗： 1.構建裸鼠Tca8113細胞皮下移植瘤動物模型：于裸鼠右腋皮下注射1×106個Tca8113細胞懸浮液,觀察成瘤情況,記錄移植瘤生長數(shù)據(jù)。 2.建模成功后藥物干預：裸鼠成瘤兩周后隨機分為6組,每組8只,分別為陰性對照組(生理鹽水,0.1ml/d)、陽性對照組(順鉑20mg/m2/d、抗-EMMPRIN單克隆抗體10mg/kg/d)、順鉑組(順鉑20mg/m2d)、抗-EMMPRIN單克隆抗體組(抗-EMMPRIN單克隆抗體10mg/kg/d)、多西環(huán)素組(多西環(huán)素20mg/ml/3d)、聯(lián)合用藥組(抗-EMMPRIN單克隆抗體10mg/kg/d、多西環(huán)素20mg/ml/3d)。開始給藥后每隔3天稱重裸鼠,游標卡尺測量腫瘤結節(jié)的長短直徑。4周后處死,連同包膜完整剝離腫瘤組織,稱重。根據(jù)腫瘤體積計算抑瘤率。 3.免疫組織化學法(SP法)檢測EMMPRIN、MMP-2、MMP-9蛋白表達：采用SP法檢測各組中裸鼠腫瘤組織內(nèi)及EMMPRIN、MMP-2, MMP-9蛋白表達。結果判定應用半定量法,以腫瘤細胞的染色陽性率來推算整個腫瘤表達情況,400倍光鏡下每張切片隨機觀察4個視野,陽性信號定位于細胞膜和細胞漿,MMP-2陽性信號定位于細胞膜和細胞漿,MMP-9陽性信號定位于細胞質和細胞膜,成棕黃色顆粒。每張切片隨機選取4個高倍視野,計數(shù)癌細胞中陽性細胞數(shù),分別按以下比例分級：0級為無明顯陽性反應細胞；1級為陽性細胞10%、弱染色：2級為陽性細胞10%～50%；3級為陽性細胞50%、強染色。0～1級判為陰性表達；2～3級判為陽性表達。 結果： 1.細胞增殖抑制實驗結果：抗-EMMPRIN單克隆抗體及多西環(huán)素聯(lián)合用藥24h、48h、72h對Tca8113細胞的增殖抑制作用強于單獨使用抗-EMMPRIN單克隆抗體和多西環(huán)素；單獨使用抗-EMMPRIN單克隆抗體對細胞的增殖抑制作用強于單獨使用多西環(huán)素,P0.05,結果具有統(tǒng)計學差異。 2.瘤體重量及抑瘤率結果：陰性對照組、陽性對照組、順鉑組、多西環(huán)素組、抗-EMMPRIN單克隆抗體組及聯(lián)合用藥組瘤體重量分別為1.12±0.31g、0.60±0.12g0.86±0.11g、0.94±0.22g、0.74±0.19g及0.55±0.17g。陰性對照組與實驗組之間差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01),陽性對照組與實驗組差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05),聯(lián)合用藥與單純用藥組差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。各組腫瘤體積變化：陰性對照組瘤體變化大,陽性對照組及三個實驗組變化較小。對照組與陽性對照組及實驗組之間差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01),聯(lián)合用藥組較抗-EMMPRIN單克隆抗體組和多西環(huán)素組變化最小(P0.05),結果具有統(tǒng)計學意義；陽性對照組與實驗組差異無統(tǒng)計學意義(P0.05),抗-EMMPRIN單克隆抗體組和多西環(huán)素組差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。陽性對照組、抗-EMMPRIN單克隆抗體組、多西環(huán)素組及聯(lián)合用藥組抑瘤率分別為37.74%、37.58%、34.28%及40.35%。 3.EMMPRIN及MMP-2, MMP-9蛋白表達：陰性對照組EMMPRIN蛋白陽性表達率為100%,MMP-2蛋白陽性表達率為100%,MMP-9蛋白陽性表達率為100%。陽性對照組EMMPRIN蛋白陽性表達率為25%,MMP-2蛋白陽性表達率為12.5%,MMP-9蛋白陽性表達率為12.5%。順鉑組EMMPRIN蛋白陽性表達率為100%,MMP-2蛋白陽性表達率為100%,MMP-9蛋白陽性表達率為100%。抗-EMMPRIN單克隆抗體組EMMPRIN蛋白陽性表達率為25%,MMP-2蛋白陽性表達率為12.5%,MMP-9蛋白陽性表達率為12.5%。多西環(huán)素組EMMPRIN蛋白陽性表達率為50%,MMP-2蛋白陽性表達率為50%, MMP-9蛋白陽性表達率為50%。聯(lián)合用藥組EMMPRIN蛋白陽性表達率為12.5%,MMP-2蛋白陽性表達率為12.5%, MMP-9蛋白陽性表達率為12.5%。 結論： 1.抗-EMMPRIN單克隆抗體及多西環(huán)素具有抑制Tca8113細胞增殖及裸鼠舌鱗癌移植瘤的生長作用,二者聯(lián)合應用抑制作用加強。 2.抗-EMMPRIN單克隆抗體及多西環(huán)素與裸鼠舌鱗癌移植瘤內(nèi)EMMPRIN及MMP-2, MMP-9蛋白表達相關,應用抗-EMMPRIN單克隆抗體及多西環(huán)素可降低EMMPRIN及MMP-2, MMP-9蛋白表達水平。 3.CD147蛋白表達下調(diào),則MMP-2, MMP-9蛋白表達亦下調(diào)。 4.EMMPRIN與順鉑聯(lián)合應用可提高舌鱗癌對順鉑敏感性從而達到抑瘤目的,與文獻報道一致。
【學位單位】：昆明醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2013
【中圖分類】：R739.86
【文章目錄】：
目錄
中文摘要
Abstract
中英文縮略表
前言
材料與方法
實驗一：聯(lián)合抗-EMMPRIN單克隆抗體、順鉑對人舌鱗癌抑制作用的研究
    1.細胞實驗
    2.動物實驗
    3.病理切片制作
    4.免疫組化檢測腫瘤標本中CD147, MMP-2, MMP-9蛋白的表達
實驗二：聯(lián)合抗-EMMPRIN單克隆抗體、多西環(huán)素對人舌鱗癌抑制作用的研究
    1.細胞實驗
    2.動物實驗
    3.病理切片制作
    4.免疫組化檢測腫瘤標本中CD147，MMP-2, MMP-9蛋白的表達
結果
討論
結論
參考文獻
綜述
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