背景:腭裂(Cleft Palate, CP)是口腔頜面部最常見的先天性發(fā)育畸形,占所有先天性畸形的65%左右,全世界新生兒發(fā)生率1/700,在我國發(fā)生率為1.82‰。在已知能誘發(fā)腭裂的環(huán)境因素中,維生素A的衍生物全反式維甲酸(all-trans retinoic acid, atRA)是致畸作用比較顯著的一種, atRA所誘導(dǎo)的腭裂形成的機制尚不明確。小鼠腭裂的發(fā)生形式與人類腭裂發(fā)生非常相似,而小鼠基因與人類的同源性高達99%以上,因此深入了解小鼠腭裂發(fā)生機制將為剖析人類腭裂發(fā)生奠定理論基礎(chǔ)。本實驗應(yīng)用穩(wěn)定的維甲酸誘導(dǎo)小鼠腭裂模型,觀察正常組和實驗組胚鼠的腭突發(fā)育的形態(tài)學(xué)變化;借助免疫組織化學(xué)法和分子生物學(xué)RT-PCR技術(shù),觀察Wnt5a基因在維甲酸誘導(dǎo)腭裂及正常對照組腭突發(fā)育中的表達和分布的改變,同時檢測信號分子Shh和FGF-10在不同的發(fā)育階段的表達水平變化。 目的:通過觀察Wnt5a與Shh, FGF-10在正常腭突發(fā)育和腭裂形成中不同發(fā)育階段的表達和分布改變,探討其在腭發(fā)育過程中發(fā)揮的作用以及維甲酸誘導(dǎo)腭裂中的發(fā)生機制;并進一步探索信號分子Wnt5a與Shh,FGF-10之間是否存在相關(guān)性。 方法:建立維甲酸誘導(dǎo)的腭裂小鼠模型,采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測Wnt5a在胚胎14, 15及16天的實驗組和對照組小鼠腭突中的蛋白水平表達和分布變化。采用RT-PCR方法檢測信號分子Wnt5a,Shh和FGF-10在轉(zhuǎn)錄水平的表達變化。 結(jié)果:1、維甲酸對腭突融合的影響:維甲酸實驗組小鼠腭裂發(fā)生率為100%。HE染色結(jié)果顯示:對照組小鼠腭突發(fā)育正常,雙側(cè)腭突在中線處接觸融合。實驗組小鼠腭突發(fā)育瘦小,腭突上抬障礙、舌體下降明顯延遲,兩側(cè)腭突不能在中線處接觸融合。2、Wnt5a蛋白表達在腭突發(fā)育各個主要時期的上皮和間充質(zhì)細(xì)胞中,且表達呈時空變化。在ED 15實驗組,Wnt5a的mRNA的表達被上調(diào)且高于對照組(P0.05)。3、Shh和FGF-10在腭突發(fā)育的不同階段持續(xù)表達,在正常對照組中Wnt5a與Shh、FGF-10表達水平的動態(tài)變化趨勢一致,在實驗組Wnt5a只與FGF-10的變化趨勢具有相關(guān)性。 結(jié)論:1、維甲酸作用于小鼠發(fā)育早期,腭突發(fā)育短小、腭突上抬障礙、舌體下降明顯延遲,兩側(cè)腭突不能在中線處接觸融合,從而導(dǎo)致腭裂的發(fā)生。2、Wnt5a參與胚胎腭突的發(fā)生發(fā)育,在腭突發(fā)育過程中的表達具有時空特異性,并與Shh和FGF-10的表達具有相關(guān)性。3、Wnt5a與Shh, FGF-10在RA誘導(dǎo)腭裂小鼠腭突組織中的異常表達提示維甲酸可能通過調(diào)節(jié)Wnt5a、Shh和FGF-10等信號分子而導(dǎo)致了腭裂。
【學(xué)位單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2008
【中圖分類】：R782.2
【部分圖文】：

結(jié) 果一 、維甲酸對腭突融合的影響1、動物模型制備情況共計得正常對照組胚鼠 68 只，實驗組胚鼠 88 只。其中正常對照組胚鼠均發(fā)育正常，實驗組胚鼠部分伴有四肢發(fā)育異常，肢芽尾巴短小，偶見眼睛發(fā)育異常。實驗組小鼠全部伴發(fā)腭裂，腭裂發(fā)生率高達 100％。2、正常胚鼠的腭突發(fā)育的形態(tài)學(xué)變化在光學(xué)顯微鏡下，觀察正常胚鼠腭部發(fā)育的動態(tài)過程：ED14 腭突位于舌體兩側(cè)垂直生長，舌體位置很高，接近鼻中隔。ED14.5 舌體開始下降，腭突開始發(fā)生上抬。ED15 舌體下降，腭突上抬至舌上方，并發(fā)生水平的定向生長，繼而兩側(cè)腭突接觸，接觸后形成中嵴上皮帶，后斷裂形成上皮島，部分中嵴上皮消失，開始融合。ED16 雙側(cè)腭突發(fā)生接觸融合，中嵴上皮完全消失，間充質(zhì)貫通，并開始骨化，腭板發(fā)育完成(圖 1)。

圖 2 維甲酸誘導(dǎo)腭裂組胚鼠腭突發(fā)育的形態(tài)學(xué)變化 HE×25A: ED14 胎鼠 B: ED15 胎鼠 C: ED16 胎鼠C57BL/6J 近交系小鼠腭突動態(tài)發(fā)育模式圖垂直生長 上 抬 水 平 生 開始融合 融合完胚胎 14 天 胚 胎 14.5 胚胎 15 天 胚胎

圖 4 Wnt5a 蛋白在腭突中的分布和表達A、 C、 E：正常對照組 ED14、 ED15、 ED16B、 D、 F：實驗組 ED14、 ED15、 ED16E×100， A、 B、 D×200， C、 F×400四、半定量 RT-PCR 檢測信號分子 Wnt5a、Shh、FGF-10 在腭突發(fā)育及維甲酸誘導(dǎo)腭裂中的表達水平1、 Wnt5a、 Shh、 FGF-10 轉(zhuǎn)錄水平表達的變化擴增產(chǎn)物經(jīng)2％的瓊脂糖凝膠電泳檢測（如圖5、7、8），獲得特異性條帶，均未見明顯雜帶及引物二聚體，擴增產(chǎn)物具有較高的特異性。Wnt5a， Shh， FGF-10 在正常腭突發(fā)育的不同階段呈現(xiàn)持續(xù)的表達，但不同發(fā)育階段表達水平不同。在維甲酸誘導(dǎo)的腭裂中與正常組的表達水平不同（表 2）。表 2 Wnt5a，Shh，F(xiàn)GF-10 半定量 RT-PCR 產(chǎn)物的光密度值比值的平均值對照組對照組對照組實驗組實驗組實驗組
【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前6條

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本文編號：2865135