背景:腭裂(Cleft Palate, CP)是口腔頜面部最常見(jiàn)的先天性發(fā)育畸形,占所有先天性畸形的65%左右,全世界新生兒發(fā)生率1/700,在我國(guó)發(fā)生率為1.82‰。在已知能誘發(fā)腭裂的環(huán)境因素中,維生素A的衍生物全反式維甲酸(all-trans retinoic acid, atRA)是致畸作用比較顯著的一種, atRA所誘導(dǎo)的腭裂形成的機(jī)制尚不明確。小鼠腭裂的發(fā)生形式與人類腭裂發(fā)生非常相似,而小鼠基因與人類的同源性高達(dá)99%以上,因此深入了解小鼠腭裂發(fā)生機(jī)制將為剖析人類腭裂發(fā)生奠定理論基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用穩(wěn)定的維甲酸誘導(dǎo)小鼠腭裂模型,觀察正常組和實(shí)驗(yàn)組胚鼠的腭突發(fā)育的形態(tài)學(xué)變化;借助免疫組織化學(xué)法和分子生物學(xué)RT-PCR技術(shù),觀察Wnt5a基因在維甲酸誘導(dǎo)腭裂及正常對(duì)照組腭突發(fā)育中的表達(dá)和分布的改變,同時(shí)檢測(cè)信號(hào)分子Shh和FGF-10在不同的發(fā)育階段的表達(dá)水平變化。 目的:通過(guò)觀察Wnt5a與Shh, FGF-10在正常腭突發(fā)育和腭裂形成中不同發(fā)育階段的表達(dá)和分布改變,探討其在腭發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮的作用以及維甲酸誘導(dǎo)腭裂中的發(fā)生機(jī)制;并進(jìn)一步探索信號(hào)分子Wnt5a與Shh,FGF-10之間是否存在相關(guān)性。 方法:建立維甲酸誘導(dǎo)的腭裂小鼠模型,采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)Wnt5a在胚胎14, 15及16天的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠腭突中的蛋白水平表達(dá)和分布變化。采用RT-PCR方法檢測(cè)信號(hào)分子Wnt5a,Shh和FGF-10在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)變化。 結(jié)果:1、維甲酸對(duì)腭突融合的影響:維甲酸實(shí)驗(yàn)組小鼠腭裂發(fā)生率為100%。HE染色結(jié)果顯示:對(duì)照組小鼠腭突發(fā)育正常,雙側(cè)腭突在中線處接觸融合。實(shí)驗(yàn)組小鼠腭突發(fā)育瘦小,腭突上抬障礙、舌體下降明顯延遲,兩側(cè)腭突不能在中線處接觸融合。2、Wnt5a蛋白表達(dá)在腭突發(fā)育各個(gè)主要時(shí)期的上皮和間充質(zhì)細(xì)胞中,且表達(dá)呈時(shí)空變化。在ED 15實(shí)驗(yàn)組,Wnt5a的mRNA的表達(dá)被上調(diào)且高于對(duì)照組(P0.05)。3、Shh和FGF-10在腭突發(fā)育的不同階段持續(xù)表達(dá),在正常對(duì)照組中Wnt5a與Shh、FGF-10表達(dá)水平的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)一致,在實(shí)驗(yàn)組Wnt5a只與FGF-10的變化趨勢(shì)具有相關(guān)性。 結(jié)論:1、維甲酸作用于小鼠發(fā)育早期,腭突發(fā)育短小、腭突上抬障礙、舌體下降明顯延遲,兩側(cè)腭突不能在中線處接觸融合,從而導(dǎo)致腭裂的發(fā)生。2、Wnt5a參與胚胎腭突的發(fā)生發(fā)育,在腭突發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)具有時(shí)空特異性,并與Shh和FGF-10的表達(dá)具有相關(guān)性。3、Wnt5a與Shh, FGF-10在RA誘導(dǎo)腭裂小鼠腭突組織中的異常表達(dá)提示維甲酸可能通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt5a、Shh和FGF-10等信號(hào)分子而導(dǎo)致了腭裂。
【學(xué)位單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2008
【中圖分類】：R782.2
【部分圖文】：

結(jié) 果一 、維甲酸對(duì)腭突融合的影響1、動(dòng)物模型制備情況共計(jì)得正常對(duì)照組胚鼠 68 只，實(shí)驗(yàn)組胚鼠 88 只。其中正常對(duì)照組胚鼠均發(fā)育正常，實(shí)驗(yàn)組胚鼠部分伴有四肢發(fā)育異常，肢芽尾巴短小，偶見(jiàn)眼睛發(fā)育異常。實(shí)驗(yàn)組小鼠全部伴發(fā)腭裂，腭裂發(fā)生率高達(dá) 100％。2、正常胚鼠的腭突發(fā)育的形態(tài)學(xué)變化在光學(xué)顯微鏡下，觀察正常胚鼠腭部發(fā)育的動(dòng)態(tài)過(guò)程：ED14 腭突位于舌體兩側(cè)垂直生長(zhǎng)，舌體位置很高，接近鼻中隔。ED14.5 舌體開(kāi)始下降，腭突開(kāi)始發(fā)生上抬。ED15 舌體下降，腭突上抬至舌上方，并發(fā)生水平的定向生長(zhǎng)，繼而兩側(cè)腭突接觸，接觸后形成中嵴上皮帶，后斷裂形成上皮島，部分中嵴上皮消失，開(kāi)始融合。ED16 雙側(cè)腭突發(fā)生接觸融合，中嵴上皮完全消失，間充質(zhì)貫通，并開(kāi)始骨化，腭板發(fā)育完成(圖 1)。

圖 2 維甲酸誘導(dǎo)腭裂組胚鼠腭突發(fā)育的形態(tài)學(xué)變化 HE×25A: ED14 胎鼠 B: ED15 胎鼠 C: ED16 胎鼠C57BL/6J 近交系小鼠腭突動(dòng)態(tài)發(fā)育模式圖垂直生長(zhǎng) 上 抬 水 平 生 開(kāi)始融合 融合完胚胎 14 天 胚 胎 14.5 胚胎 15 天 胚胎

圖 4 Wnt5a 蛋白在腭突中的分布和表達(dá)A、 C、 E：正常對(duì)照組 ED14、 ED15、 ED16B、 D、 F：實(shí)驗(yàn)組 ED14、 ED15、 ED16E×100， A、 B、 D×200， C、 F×400四、半定量 RT-PCR 檢測(cè)信號(hào)分子 Wnt5a、Shh、FGF-10 在腭突發(fā)育及維甲酸誘導(dǎo)腭裂中的表達(dá)水平1、 Wnt5a、 Shh、 FGF-10 轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)的變化擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（如圖5、7、8），獲得特異性條帶，均未見(jiàn)明顯雜帶及引物二聚體，擴(kuò)增產(chǎn)物具有較高的特異性。Wnt5a， Shh， FGF-10 在正常腭突發(fā)育的不同階段呈現(xiàn)持續(xù)的表達(dá)，但不同發(fā)育階段表達(dá)水平不同。在維甲酸誘導(dǎo)的腭裂中與正常組的表達(dá)水平不同（表 2）。表 2 Wnt5a，Shh，F(xiàn)GF-10 半定量 RT-PCR 產(chǎn)物的光密度值比值的平均值對(duì)照組對(duì)照組對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)組
【參考文獻(xiàn)】

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1 張露;Shh信號(hào)分子在牙胚發(fā)育中的調(diào)控作用[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).口腔醫(yī)學(xué)分冊(cè);2002年05期

2 朱江波,張?zhí)鞂?腭裂動(dòng)物模型的研究現(xiàn)狀[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).口腔醫(yī)學(xué)分冊(cè);2005年02期

3 張彥聰;高慶紅;溫玉明;;Shh基因和Nell-1基因在顱頜面發(fā)育中的作用[J];國(guó)際口腔醫(yī)學(xué)雜志;2007年04期

4 顧鳴敏,陳仁彪;多基因遺傳病遺傳分析的研究進(jìn)展[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).遺傳學(xué)分冊(cè);1998年02期

5 呂寶輝,黃洪章;RA誘導(dǎo)小鼠腭裂動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)研究[J];口腔醫(yī)學(xué)研究;2002年04期

6 姜篤銀,付小兵;FGF10:胚胎器官發(fā)育中重要的多功能信號(hào)分子[J];中國(guó)生物工程雜志;2003年03期

本文編號(hào)：2865135