牙周炎是一種由菌斑細(xì)菌引發(fā)的慢性感染性疾病,是人類口腔兩大疾病之一,發(fā)病率較高。大量的研究顯示慢性牙周炎已成為心血管疾病的獨立危險因素,使動脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)和冠心病等心血管疾病的患病風(fēng)險大大增加。以往的理論認(rèn)為AS主要是局部脂質(zhì)堆積性疾病,近年來,AS發(fā)病機制的炎癥觀點又重新被強調(diào)。目前研究認(rèn)為AS是一個進行性的炎癥反應(yīng),局部和遠(yuǎn)隔部位感染可以促進AS的慢性炎癥過程。由于AS病因復(fù)雜,既包括與脂蛋白代謝有關(guān)的基因,也包括環(huán)境因素的影響,且病變發(fā)生較慢,在早期無癥狀,故對其病因和發(fā)病機制的研究進展仍然較慢。而大多數(shù)的牙周疾病是可以預(yù)防和控制的,有效的牙周治療、積極的控制口腔感染為我們提供了一條減少心血管疾病發(fā)生危險的可能途徑。 牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis, P. gingivalis)是目前公認(rèn)的慢性牙周炎重要可疑致病菌,它的多種毒性因子可引發(fā)宿主的免疫炎癥反應(yīng),導(dǎo)致牙齦組織破壞和局部血管改變,使菌血癥發(fā)生的可能性和嚴(yán)重性大大增加。Haraszthy和Kozarov等用PCR的方法證實AS斑塊內(nèi)P. gingivalis的存在；Lalla和Gibson等的動物實驗研究顯示P. gingivalis通過口腔感染載脂蛋白E缺陷小鼠可增加早期AS和血管炎癥的發(fā)生。還有研究表明P. gingivalis能夠進入血液循環(huán)系統(tǒng),進而粘附、侵入血管內(nèi)皮細(xì)胞,并在細(xì)胞內(nèi)增殖,這使P. gingivalis感染與AS疾病的聯(lián)系更加密切。同其他血管壁細(xì)胞一樣,血管內(nèi)皮細(xì)胞可能作為P. gingivalis菌體或菌體成分的儲存庫,在P. gingivalis感染機體的過程中刺激機體產(chǎn)生免疫炎癥反應(yīng)。 在AS疾病發(fā)生過程中,血管內(nèi)皮細(xì)胞是單核細(xì)胞粘附聚集的關(guān)鍵部位,細(xì)胞-細(xì)胞、細(xì)胞-基質(zhì)間相互粘附、相互作用幾乎貫穿了AS的整個病理過程,因此了解引起細(xì)胞間相互作用的因素及機理,采取相應(yīng)的措施,對防治血管病發(fā)生、發(fā)展有著重要意義。細(xì)胞間粘附的分子基礎(chǔ)是粘附分子表達,在體內(nèi)正常細(xì)胞不表達或僅輕微表達粘附分子,在AS斑塊部位發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞活化,大量表達細(xì)胞粘附分子,包括細(xì)胞間粘附分子1(intercellular adhesion molecule 1, ICAM-1)、血管細(xì)胞粘附分子1(vascular cell adhesion molecule 1, VCAM-1)和E選擇素等,其作用主要是通過識別并結(jié)合對方細(xì)胞膜上的特異性配體而完成細(xì)胞間的粘附。內(nèi)皮細(xì)胞分泌的粘附分子對AS病變的形成和發(fā)展有重要作用。 我們推測P. gingivalis侵入血管內(nèi)皮細(xì)胞可導(dǎo)致粘附分子高表達的AS樣改變。本研究建立P. gingivalis侵入血管內(nèi)皮細(xì)胞模型,模擬P. gingivalis感染血管壁細(xì)胞的體內(nèi)環(huán)境,觀察P. gingivalis侵入后粘附分子ICAM-1、VCAM-1和E選擇素表達的變化,探討P. gingivalis在AS疾病發(fā)生中的可能作用,并進一步完成調(diào)控細(xì)胞粘附分子表達的信號通路的初探。 材料與方法 一、實驗材料 P. gingivalis低毒力株ATCC 33277(由首都醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院科研所提供)和高毒力株W83(由美國佛羅里達大學(xué)牙科學(xué)院口腔生物研究所Dr. Lamont RJ教授惠贈)，人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vain endothelial cell, HUVEC)株ECV304(購自南京凱基生物科技開發(fā)有限公司),甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT) (Sigma), Annexin-V-FITC凋亡檢測試劑盒(深圳晶美生物技術(shù)有限公司),碘化丙啶(propidium iodide, PI) (Sigma),DNA抽提試劑盒(Qiagen),RNA提取試劑Trizol Reagent (Invitrogen), RT-PCR試劑盒(TaKaRa),鼠抗人ICAM-1單克隆抗體(Santa Cruz),兔抗人VCAM-1、E選擇素多克隆抗體(Santa Cruz),兔β-肌動蛋白(actin)多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司),鼠抗人IκB-α、磷酸化p38MAPK、NF-κB p65單克隆抗體(Santa Cruz),堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗鼠或羊抗兔IgG(北京博奧森生物技術(shù)有限公司),異硫氰酸熒光素(Fluorescein isothiocynate, FITC)標(biāo)記的羊抗鼠或羊抗兔IgG(北京博奧森生物技術(shù)有限公司),MG132 (CALIOCHEM), SB203580 (Promega) 二、實驗方法 1、選擇P. gingivalis低毒力株ATCC 33277和高毒力株W83、人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株,建立P. gingivalis ATCC 33277和W83侵入HUVEC模型。 2、MTT比色法檢測P. gingivalis侵入前后細(xì)胞增殖活性變化,流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期。 3、Annexin V-FITC凋亡試劑盒檢測細(xì)胞凋亡率,免疫熒光染色和細(xì)胞核DNA階梯狀圖譜電泳分析進一步證實細(xì)胞凋亡 4、RT-PCR和Western印跡法檢測P. gingivalis侵入血管內(nèi)皮細(xì)胞前后ICAM-1、VCAM-1和E選擇素基因的mRNA及蛋白表達變化,細(xì)胞免疫熒光染色法測定ICAM-1、VCAM-1和E選擇素膜蛋白表達。 5、Western印跡法檢測IκB-α和磷酸化p38 MAPK表達；間接免疫熒光法檢測HUVEC NF-κB p65核移位。 6、NF-κB抑制劑MG132和p38 MAPK抑制劑SB203580預(yù)處理細(xì)胞后,分別建立P. gingivalis ATCC 33277和W83侵入模型,分析NF-κB/IκB和p38 MAPK信號通路在P. gingivalis侵入血管內(nèi)皮細(xì)胞影響粘附分子表達過程中的作用。 三、統(tǒng)計分析 結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,實驗重復(fù)3次,采用SAS 8.12軟件包,多組均數(shù)之間的比較采用重復(fù)測量資料的方差分析,P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 實驗結(jié)果 1、牙齦卟啉單胞菌侵入對血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡的影響 P. gingivalis侵入后48h,未見細(xì)胞增殖受抑制。與對照組比較,P. gingivalis ATCC 33277侵入后72h,細(xì)胞增殖活性降低12.46%；W83侵入后72h,細(xì)胞增殖活性降低10.47%,細(xì)胞生長增殖活性明顯受抑制(P0.05)。P. gingivalis ATCC 33277和W83的增殖抑制作用無顯著性差異(P0.05)；P. gingivalis侵入改變細(xì)胞周期分布,使G1期細(xì)胞增加(P0.05),細(xì)胞周期在G1期發(fā)生阻滯,P. gingivalis W83使細(xì)胞周期發(fā)生改變的時間(24h)早于ATCC 33277 (48h); P. gingivalis侵入后24h即誘導(dǎo)凋亡細(xì)胞的產(chǎn)生(P0.05)。P. gingivalis W83侵入后72h,死亡細(xì)胞明顯增加(16.407%),與ATCC 33277侵入組(11.973%)比較有顯著差異(P0.05)。熒光顯微鏡觀察證實凋亡細(xì)胞的存在；階梯狀電泳圖譜分析顯示P.gingivalis W83作用后24h和48h,HUVEC的核DNA呈現(xiàn)明顯的拖尾條帶,形成典型的DNA ladder. 2、牙齦卟啉單胞菌侵入對血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子表達的的影響P. gingivalis ATCC 33277和W83侵入后4h即誘導(dǎo)ICAM-1、VCAM-1和E選擇素mRNA表達(P0.05)。ICAM-1和VCAM-1 mRNA表達水平在P. gingivalis侵入后8h達高峰(P0.05),這種高表達可持續(xù)到P. gingivalis侵入后24h(P0.05)。E選擇素mRNA表達在P. gingivalis侵入后4h達高峰(P0.05),8h顯著回落(P0.05),至24h時接近基礎(chǔ)表達水平(P0.05)；P. gingivalis ATCC 33277和W83侵入后4h即誘導(dǎo)ICAM-1、VCAM-1和E選擇素膜蛋白表達(P0.05),ICAM-1和VCAM-1蛋白表達在侵入后8h和24h有持續(xù)的高表達(P0.05)；E選擇素蛋白表達在侵入后8h達高峰,侵入后24h仍有較高的表達(P0.05)；P. gingivalis W83誘導(dǎo)ICAM-1、VCAM-1和E選擇素nRNA和蛋白表達的能力強于ATCC 33277(P0.05).細(xì)胞免疫熒光染色證實P. gingivalis W83侵入血管內(nèi)皮細(xì)胞后8h誘導(dǎo)ICAM-1、VCAM-1和E選擇素膜蛋白的表達。 3、牙齦卟啉單胞菌感染血管內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)IκB降解、p38 MAPK磷酸化和NF-κB p65核移位 P. gingivalis ATCC 33277感染HUVEC后60min導(dǎo)致IκB-α降解,感染后90minIκB-α恢復(fù)至基礎(chǔ)水平；P. gingivalis W83感染后30min后即導(dǎo)致IκB-α降解,60min后IκB-α蛋白水平有輕度回升,90min后IκB-α恢復(fù)至基礎(chǔ)水平；P. gingivalis W83感染使細(xì)胞IKB-a降解時間早于ATCC 33277. P. gingivalis ATCC 33277作用于細(xì)胞后30min后導(dǎo)致p38 MAPK磷酸化,60min后p38 MAPK磷酸化水平明顯降低,90min后恢復(fù)至基礎(chǔ)水平；P. gingivalis W83感染HUVEC后60min導(dǎo)致p38 MAPK磷酸化,90min后p38 MAPK磷酸化水平明顯降低。P. gingivalis ATCC 33277感染HUVEC后60min開始激活NF-κB p65核移位,感染后90min,核移位現(xiàn)象更明顯；W83感染HUVEC后30min即開始有NF-κB p65核移位,核移位一直持續(xù)到W83感染后90min。 4、NF-κB和]p38 MAPK信號通路抑制劑在P. gingivalis感染HUVEC誘導(dǎo)IκB-α降解、p38 MAPK磷酸化、NF-κB p65核移位和粘附分子表達過程中的作用 NF-κB抑制劑MG132(20μM)和P38 MAPK抑制劑SB203580(10μM)預(yù)處理細(xì)胞30min后,再分別與P. gingivalis ATCC 33277和W83(MOI=100：1)共同培養(yǎng)60min、90min和8h。Western印跡法檢測IκB-α和磷酸化p38 MAPK蛋白表達變化,細(xì)胞免疫熒光染色檢測NF-κB P65核移位。結(jié)果顯示MG132可抑制P. gingivalis W83感染HUVEC誘導(dǎo)的IκB-α降解、NF-κB p65核移位和ICAM-1、VCAM-1、E-selectin mRNA和蛋白表達,對p38 MAPK磷酸化無影響；SB203580可抑制P. gingivalis W83感染導(dǎo)致的p38 MAPK磷酸化,對IκB-α降解、NF-κB p65核移位和ICAM-1、VCAM-1、E-selectin mRNA和蛋白表達無影響。 結(jié)論 1、P. gingivalis侵入血管內(nèi)皮細(xì)胞可抑制其增殖,使細(xì)胞周期在G1期細(xì)胞發(fā)生阻滯,并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及ICAM-1、VCAM-1、E選擇素mRNA和蛋白高表達的AS樣改變,在AS炎癥病理反應(yīng)中有重要的意義。有效的牙周治療、積極的控制口腔感染為我們提供了一條減少心血管疾病發(fā)生危險的可能途徑。 2、P. gingivalis ATCC 33277和W83侵入血管內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)IκB降解、p38 MAPK磷酸化和NF-κB核移位。NF-κB系統(tǒng)的活化參與了P. gingivalis侵入HUVEC誘導(dǎo)粘附分子表達的過程,NF-κB系統(tǒng)在P. gingivalis感染后的全身炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要的調(diào)控作用,對其進行有效的阻斷和調(diào)節(jié),將可能控制P. gingivalis感染導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子高表達的AS樣改變。 3、與低毒力株P(guān). gingivalis ATCC 33277比較,高毒力株P(guān). gingivalis W83顯示更強的細(xì)胞毒性,侵入后72h導(dǎo)致更多的細(xì)胞死亡P. gingivalis W83誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1、VCAM-1和E-selectin表達的能力強于P. gingivalis ATCC 33277,這可能與其侵襲性或致膿腫作用有關(guān)。
【學(xué)位單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2008
【中圖分類】：R781.4
【文章目錄】：
一、摘要
    中文論著摘要
    英文論著摘要
二、英文縮略語
三、論文
    論文一、牙齦卟啉單胞菌侵入對血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡的影響
        前言
        材料和方法
        實驗結(jié)果
        討論
        結(jié)論
    論文二、牙齦卟啉單胞菌侵入對血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子表達的的影響
        前言
        材料和方法
        實驗結(jié)果
        討論
        結(jié)論
    論文三、NF-kB和p38 MAPK信號通路在牙齦卟啉單胞菌誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子表達中的作用
        前言
        材料和方法
        實驗結(jié)果
        討論
        結(jié)論
四、本研究創(chuàng)新性自我評價
五、參考文獻
綜述
    參考文獻
在學(xué)期間科研成績
致謝
個人簡介

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前7條

1 黃定明,吳亞菲,周學(xué)東;牙齦紫質(zhì)單胞菌菌毛fimA的致病機理[J];國外醫(yī)學(xué).口腔醫(yī)學(xué)分冊;2001年06期

2 鄒德榮,劉翳雯,陳儀,戴其昌;牙周炎患者齦溝液中IL-8的含量測定[J];上�？谇会t(yī)學(xué);2001年04期

3 毛松,陳森,何安光;牙齦卟啉單胞菌對臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞表達IL-8和MCP-1 mRNA的影響[J];牙體牙髓牙周病學(xué)雜志;2002年02期

4 劉銳,楊圣輝;牙齦卟啉單胞菌蛋白酶及疫苗的研究進展[J];中國微生態(tài)學(xué)雜志;2003年03期

5 陳莉麗,嚴(yán)杰,倪可夫;牙齦卟啉菌脂多糖誘生的IL-1、TNF和PGE的骨吸收活性[J];中國微生態(tài)學(xué)雜志;1997年01期

6 林莉;潘亞萍;李琛;;牙齦卟啉單胞菌不同毒力株基因差異的比較研究[J];中華口腔醫(yī)學(xué)雜志;2006年12期

7 楊壯群;蘭海龍;屠軍波;宋勇;張鐵良;邢喆;;脂質(zhì)體魚肝油酸鈉促ECV-304系細(xì)胞凋亡作用的實驗研究[J];中華口腔醫(yī)學(xué)雜志;2007年03期

本文編號：2863699