發(fā)布時間：2020-10-30 09:37

　　 目的: 人牙周膜細(xì)胞作為牙周組織的基礎(chǔ)細(xì)胞,在牙周組織的再生和修復(fù)中發(fā)揮著重要作用。本課題旨在探討黃芩莖葉提取物-野黃芩苷對牙周膜細(xì)胞的保護(hù)作用,為野黃芩苷應(yīng)用于臨床治療牙周病提供理論和實驗依據(jù)。 方法: 1無菌取青少年因正畸拔除的健康牙,體外原代培養(yǎng)牙周膜細(xì)胞,免疫細(xì)胞化學(xué)方法鑒定細(xì)胞來源。 2實驗分組及干預(yù):分為正常對照組、LPS干預(yù)組、不同濃度野黃芩苷+LPS干預(yù)組。正常對照組用2% FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)牙周膜細(xì)胞;LPS組用100μg/ml的LPS處理細(xì)胞;野黃芩苷+LPS組分別用0.001μg/ml、0.01μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml的野黃芩苷和100μg/ml的LPS處理細(xì)胞。 3采用四唑鹽比色(MTT)方法,觀察野黃芩苷對LPS作用的人牙周膜細(xì)胞增殖活性的影響。 4采用流式細(xì)胞技術(shù)觀察野黃芩苷對LPS作用的人牙周膜細(xì)胞的細(xì)胞周期的影響。 5采用酶動力學(xué)方法觀察野黃芩苷對LPS抑制人牙周膜細(xì)胞的堿性磷酸酶活性的作用。 6采用酶聯(lián)免疫方法(ELISA)檢測人牙周膜細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的TNF-α水平。 7采用蛋白印跡(Western-blot)技術(shù)檢測人牙周膜細(xì)胞MMP-1、MMP-2的表達(dá)情況。 8數(shù)據(jù)處理采用SPSS11.5統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行,采用單因素方差分析和LSD-t檢驗, P 0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果: 1體外培養(yǎng)牙周膜細(xì)胞成功后,對第三代細(xì)胞進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定,顯示細(xì)胞波形絲蛋白陽性、角蛋白染色陰性,確定為牙周膜細(xì)胞。 2野黃芩苷對牙周膜細(xì)胞增殖活性的影響 LPS干預(yù)組牙周膜細(xì)胞24h、48h、72h與相應(yīng)同期正常對照組相比,牙周膜細(xì)胞增殖活性均明顯降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05,P0.01),說明100μg/ml LPS能明顯抑制牙周膜細(xì)胞的增殖活性。同時段加入0.001μg/ml、0.01μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml不同濃度的野黃芩苷干預(yù)后,與LPS組相比,0.01μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml濃度的野黃芩苷作用牙周膜細(xì)胞24h;0.001μg/ml、0.01μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml濃度的野黃芩苷作用牙周膜細(xì)胞48h; 0.1μg/ml、1μg/ml濃度的野黃芩苷作用牙周膜細(xì)胞72h時,牙周膜細(xì)胞增殖活性增加,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P 0.05,P 0.01),提示野黃芩苷具有拮抗LPS抑制牙周膜細(xì)胞增殖活性的作用。 3野黃芩苷對牙周膜細(xì)胞的細(xì)胞周期影響 牙周膜細(xì)胞經(jīng)100μg/ml LPS處理24h,G0/G1期、S期、G2M期細(xì)胞所占百分比分別與正常對照組的對應(yīng)時相相比有所不同,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P 0.05)。同時段加入1μg/ml濃度野黃芩苷后,G0/G1期所占百分比降低,而G2M期所占百分比和增殖指數(shù)(Prl值)明顯升高,與LPS組比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P 0.05)。 4野黃芩苷對牙周膜細(xì)胞堿性磷酸酶活性的影響 100μg/ml LPS處理牙周膜細(xì)胞72h,與正常對照組相比,ALP活性顯著受到抑制(P 0.01)。同時段加入0.001μg/ml、0.01μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml不同濃度野黃芩苷后,在較低濃度0.001μg/ml、0.01μg/ml時作用不明顯,0.1μg/ml對LPS抑制ALP活性已有明顯的拮抗作用(P 0.05),在1μg/ml時拮抗作用達(dá)到高峰(P 0.01)。 5野黃芩苷對牙周膜細(xì)胞分泌TNF-α的影響 正常對照組的牙周膜細(xì)胞分泌較低水平的TNF-α。經(jīng)100μg/ml LPS處理24h,牙周膜細(xì)胞分泌TNF-α水平提高,與正常對照組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。同時段加入0.001μg/ml、0.01μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml不同濃度野黃芩苷,各濃度的野黃芩苷對LPS刺激TNF-α分泌均有顯著的抑制作用(P 0.01),其中在野黃芩苷濃度1μg/ml時抑制作用達(dá)到最大,并且與較低濃度0.001μg/ml、0.01μg/ml野黃芩苷組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P 0.01)。 6野黃芩苷對牙周膜細(xì)胞MMP-1、MMP-2蛋白表達(dá)的影響 6.1 MMP-1蛋白表達(dá)的結(jié)果 Western-Blot檢測顯示:HPDLCs經(jīng)100μg/ml的LPS處理24h后,MMP-1蛋白表達(dá)量比正常對照組有所增多,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。同時段加入0.001μg/ml、0.01μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml不同濃度野黃芩苷后,隨著藥物濃度的增加,MMP-1蛋白表達(dá)量有減少趨勢,但與LPS組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P 0.05)。 6.2 MMP-2蛋白表達(dá)的結(jié)果 Western-Blot檢測顯示:正常對照組HPDLCs表達(dá)較低水平的MMP-2蛋白,100μg/ml的LPS處理HPDLCs 24h,MMP-2蛋白表達(dá)量增多,與正常對照組相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P 0.05)。同時段加入0.001μg/ml、0.01μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml不同濃度野黃芩苷,MMP-2蛋白表達(dá)有所減少,但僅在10μg/ml野黃芩苷組,與LPS組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P 0.05)。 結(jié)論: 1 100μg/ml LPS抑制牙周膜細(xì)胞的增殖和堿性磷酸酶活性,誘導(dǎo)牙周膜細(xì)胞的TNF-α的分泌和MMP-2蛋白表達(dá)。 2加入不同濃度的野黃芩苷能拮抗LPS對牙周膜細(xì)胞增殖和堿性磷酸酶活性的抑制作用,并且能抑制TNF-α的分泌和MMP-2蛋白表達(dá)。 3本研究結(jié)果提示,野黃芩苷對人牙周膜細(xì)胞有保護(hù)作用。
【學(xué)位單位】：承德醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2010
【中圖分類】：R781.4
【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
英文縮寫
研究論文 野黃芩苷對人牙周膜細(xì)胞保護(hù)作用的實驗研究
    前言
    材料與方法
    結(jié)果
    附圖
    附表
    討論
    結(jié)論
    參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
致謝
個人簡歷

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本文編號：2862294