目的探討人口腔牙齦鱗癌中癌相關(guān)成纖維細胞(carcinoma associated fibroblasts, CAFs)的體外增殖、黏附、侵襲、遷移能力,并研究其特殊相關(guān)蛋白表達,以口腔牙齦正常成纖維細胞(normal fibrolasts, NFs)作為對照;同時研究其體外異常侵襲、遷移能力與其細胞中成纖維細胞激活蛋白(fibroblast activation protein, FAP)、α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)及基質(zhì)金屬蛋白酶-2 (matrix metalloprotease-2, MMP-2)表達水平的關(guān)系。 方法應用組織塊貼壁法原代培養(yǎng)同一病人口腔牙齦CAFs及NFs;取三代以后純化細胞進行形態(tài)觀察,免疫組化染色、細胞增殖活性、貼壁率、劃痕實驗及transwell侵襲測試等,比較兩種細胞的體外生物學行為差異;應用Matrigel凝膠包被過的transwell小室初步篩選非侵襲性細胞株CAFs-NI (carcinoma associated fibroblasts-non-invasive)及侵襲性細胞株CAFs-HI (carcinoma associated fibroblasts hyper -invasive),行免疫組化染色、Western Bloting免疫印記檢測、流式細胞免疫熒光計數(shù),分析其FAP、α-SMA、MMP-2三種蛋白表達水平差異。 結(jié)果 1純化后的CAFs及NFs鏡下呈現(xiàn)不同細胞形態(tài)及生長特性;兩種細胞均表現(xiàn)為典型的‘S’形生長曲線,但是CAFs的體外增殖活性明顯高于NFs;兩種細胞各時間點貼壁率比較CAFs亦高于NFs;劃痕實驗表明,CAFs細胞運動能力更強,24h后可基本修復0.8mm的劃痕,NFs遷移能力相對較低,CAFs的transwell侵襲能力也明顯高于高于NFs (P0.05)。 2免疫組化染色鑒定發(fā)現(xiàn),兩種細胞均表現(xiàn)為波形蛋白(Vimentin)陽性表達及角蛋白(Cytokeratin)陰性表達,但是CAFs可有FAP、α-SMA及MMP-2的特異表達,而NFs則為陰性。 3免疫組化染色、Western Bloting免疫印記檢測、流式細胞免疫熒光計數(shù)結(jié)果顯示FAP、α-SMA及MMP-2三種蛋白在高侵襲性細胞株CAFs-HI中的表達水平均比CAFs-NI高(P0.05)。 結(jié)論 1口腔牙齦CAFs體外增殖、粘附、遷移、侵襲能力均高于NFs; 2口腔牙齦CAFs可特征性表達FAP、α-SMA及MMP-2等相關(guān)蛋白; 3口腔牙齦CAFs體外高侵襲能力與其FAP、MMP-2、α-SMA蛋白表達水平正相關(guān),這三種蛋白可能介導CAFs某些特殊的生物學行為。
【學位單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2009
【中圖分類】：R739.8
【部分圖文】：

2 結(jié)果2.1 細胞體外原代培養(yǎng)特點倒置相差顯微鏡下觀察：4 天后，癌組織塊邊緣即有細逐漸形成暈圈包繞組織塊，多數(shù)細胞梭形，間雜多邊形細胞上皮細胞大量凋亡，成纖維細胞生長旺盛。癌組織培養(yǎng) 2 80%，見圖 1-2，進行首次傳代。正常組織首次傳代在 3 周胞繼續(xù)生長，上皮細胞逐漸凋亡，數(shù)量更少；此后成纖維速度更快，6-7 天可傳一代；經(jīng) 3 代后即全部純化為成纖維下可見：NFs 呈樹枝狀，胞體舒展，胞漿豐富，胞質(zhì)突多見胞大小一致，界限清楚，低密度時交織成網(wǎng)狀，高密度時疊生長，見圖 2-1。CAFs 大小形狀不一，多為長梭形，胞細胞，高密度時排列紊亂，可重疊生長,接觸抑制喪失，見

南京醫(yī)科大學圖 2 純化的 CAFs 及 NFs 鏡下形態(tài)。1 為 NFs 生長狀態(tài)，2 為 CAFs 生長狀態(tài)鏡 ×100）2.2 免疫細胞化學染色結(jié)果純化后的 CAFs 表現(xiàn)典型的間充值細胞特點 Vimentin 強陽Cytokeratin 陰性表達，與 NFs 相似，見圖 3。但是與 NFs 相比，CAF達 α-SMA、MMP-2、FAP 蛋白，而 NFs 中此三種蛋白均為陰性表達的圖片見圖 4。詳細的 CAFs 及 NFs 免疫細胞化學染色結(jié)果比較見表

FAP 陰性表達，3 為 CAFs 中 MMP-2 陽性表達，4 為 CAFs 中胞化學 ×200）表 1 CAFs 及 NFs 免疫細胞化學染色α-SMA MMP-2 FAP VimCAFs + + + + NFs - - - + 2.3 兩種細胞增殖活性及生長曲線CAFs 及 NFs 均表現(xiàn)典型的‘S’形生長曲線，‘潛伏3-5 天為對數(shù)生長期。同樣培養(yǎng)條件下，CAFs 增殖活性兩種細胞生長曲線見圖 5。
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本文編號：2859601