目的:1.探討靜壓力對(duì)聚乳酸-乙醇酸聚合物(PLGA)支架上人牙齦成纖維細(xì)胞(HGFs)中整合素α5β1、黏著班激酶(FAK)、磷酸化FAK(p-FAK)及Ⅰ型膠原蛋白(COL-Ⅰ)表達(dá)的影響;2.探討抑制HGFs中整合素α5β1的表達(dá)后,FAK、p-FAK和COL-Ⅰ表達(dá)的變化情況,以初步探討整合素α5β1在HGFs的機(jī)械力學(xué)信號(hào)傳導(dǎo)和纖維化過(guò)程中的作用機(jī)制。方法:1、采用組織塊培養(yǎng)法進(jìn)行HGFs的原代培養(yǎng);取第4-6代的HGFs接種于PLGA支架上,構(gòu)建HGFs的三維培養(yǎng)模型。2、采用重物加載模型,對(duì)PLGA-HGFs復(fù)合體施加25g/cm2的靜壓力,作用時(shí)間分別為0、3、6、12、24、48小時(shí)。采用RT-qPCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)三維培養(yǎng)的HGFs整合素α5β1、FAK、p-FAK和COL-Ⅰ的mRNA與蛋白表達(dá)變化情況。3、利用整合素α5β1抑制劑(ATN-161)構(gòu)建HGFs的整合素α5β1抑制模型。采用CCK-8技術(shù)檢測(cè)不同濃度(0、10nM、100nM、1μM、10μM、100μM、1mM)的ATN-161對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響,作用時(shí)間分別是0、24、48、72小時(shí);采用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)不同濃度(0、10nM、100nM、1μM、10μM)的ATN-161對(duì)HGFs表達(dá)整合素α5β1 mRNA的影響情況,作用時(shí)間為48小時(shí)。4、對(duì)PLGA-HGFs復(fù)合體加入濃度為1μM的ATN-161,作用時(shí)間分別為0、3、6、12、24、48小時(shí);對(duì)PLGA-HGFs復(fù)合體加入濃度為1μM的ATN-161后,施加25g/cm2的靜壓力,作用時(shí)間分別為0、3、6、12、24、48小時(shí),采用RT-qPCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)三維培養(yǎng)的HGFs整合素α5β1、FAK、p-FAK和COL-Ⅰ的mRNA與蛋白表達(dá)變化情況。結(jié)果:1、采用組織塊培養(yǎng)法成功培養(yǎng)出原代細(xì)胞,經(jīng)傳代純化細(xì)胞,性狀穩(wěn)定,取第4-6代HGFs接種于PLGA支架,構(gòu)建PLGA-HGFs三維培養(yǎng)模型。2、對(duì)PLGA支架上HGFs施加25 g/cm2的靜壓力后,HGFs整合素α5β1、FAK(p-FAK)和COL-Ⅰ的mRNA和蛋白表達(dá)量均上調(diào)。整合素α5β1、FAK的mRNA和蛋白表達(dá)量在3-6h時(shí)表達(dá)量最高,6h后緩慢下降;磷酸化FAK蛋白表達(dá)量在12h時(shí)表達(dá)量達(dá)到峰值,12h后逐漸下降,趨于正常值;COL-Ⅰ的mRNA和蛋白表達(dá)量均升高,在24h時(shí)表達(dá)量最高,24h后緩慢下降。與整合素α5β1、FAK相比,COL-Ⅰ的變化反應(yīng)較慢。3、在72h內(nèi),濃度低于或等于10μM時(shí),ATN-161對(duì)HGFs增殖活性無(wú)明顯影響。濃度高于10μM后,ATN-161對(duì)HGFs增殖活性有明顯影響,隨著時(shí)間,抑制作用逐漸增強(qiáng)。濃度為1μM的ATN-161對(duì)整合素α5β1的抑制作用最為顯著。4、在加入濃度為1μM的ATN-161實(shí)驗(yàn)組中,HGFs的整合素α5β1、FAK(p-FAK)、COL-ⅠmRNA和蛋白表達(dá)量均有下降。在PLGA-HGFs復(fù)合體中加入濃度為1μM的ATN-161后,靜壓力作用下HGFs的整合素α5β1、FAK、COL-ⅠmRNA表達(dá)量在3h時(shí)稍有升高,3h后均降低,且低于對(duì)照組;整合素α5β1、FAK、COL-Ⅰ的蛋白水平總體上也均有降低;COL-Ⅰ的蛋白表達(dá)量在3-6h時(shí)有顯著的升高,6h后逐漸下降。結(jié)論:1、本研究成功構(gòu)建了PLGA-HGFs三維培養(yǎng)及力學(xué)加載模型。2、靜壓力可以促進(jìn)HGFs整合素α5β1、FAK(p-FAK)和COL-ⅠmRNA與蛋白的表達(dá),整合素α5β1和FAK參與HGFs力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。3、靜壓力作用下,整合素α5β1感應(yīng)力學(xué)信號(hào),調(diào)控下游FAK的表達(dá)和磷酸化水平,影響細(xì)胞合成COL-Ⅰ,從而參與細(xì)胞外基質(zhì)的纖維化過(guò)程。
【學(xué)位單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類(lèi)】：R783.5
【部分圖文】：

圖 1-1 細(xì)胞加力模型圖Fig1-1 The modified “weight” method for loading compressive forceA HGFs 的原代培養(yǎng) ×40 B HGFs 的傳代培養(yǎng) ×40圖 1-2 HGFs 培養(yǎng)Fig1-2 The culture of human gingival fibroblasts

HGFs培養(yǎng)

圖2-1 A：靜壓力對(duì)HGFs表達(dá)整合素α5 mRNA的影響；B：靜壓力對(duì)HGFs表達(dá)整合素β1 mRNA的影響；C：靜壓力對(duì) HGFs 表達(dá) FAK mRNA 的影響；D：靜壓力對(duì) HGFs 表達(dá) COL-Ⅰ mRNA 的影響Fig2-1 A: The mRNAexpression of Integrinα5 under compressive force; B:The mRNA expressionof Integrinβ1under compressive force; C:The mRNA expression of FAK under compressiveforce; D: The mRNA expression of COL-Ⅰ under compressive force注：*表示不同加力時(shí)間組與未加力組之間比較 P＜0.05。結(jié)果顯示：對(duì) PLGA 支架上 HGFs 施加 25g/cm2的靜壓力后，與未加力組相比，整合素 α5 的 mRNA 表達(dá)量在 12 小時(shí)內(nèi)均顯示上調(diào)，在 6 小時(shí)的表達(dá)量最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)；在加力 6 小時(shí)之后，整合素 α5 的 mRNA 表達(dá)量逐漸恢復(fù)至未加力（0 小時(shí)）組水平。與未加力組相比，整合素 β1 的 mRNA 表達(dá)量在 48 小時(shí)內(nèi)均
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本文編號(hào)：2856545