目的:1.探討靜壓力對聚乳酸-乙醇酸聚合物(PLGA)支架上人牙齦成纖維細胞(HGFs)中整合素α5β1、黏著班激酶(FAK)、磷酸化FAK(p-FAK)及Ⅰ型膠原蛋白(COL-Ⅰ)表達的影響;2.探討抑制HGFs中整合素α5β1的表達后,FAK、p-FAK和COL-Ⅰ表達的變化情況,以初步探討整合素α5β1在HGFs的機械力學(xué)信號傳導(dǎo)和纖維化過程中的作用機制。方法:1、采用組織塊培養(yǎng)法進行HGFs的原代培養(yǎng);取第4-6代的HGFs接種于PLGA支架上,構(gòu)建HGFs的三維培養(yǎng)模型。2、采用重物加載模型,對PLGA-HGFs復(fù)合體施加25g/cm2的靜壓力,作用時間分別為0、3、6、12、24、48小時。采用RT-qPCR和Western blot技術(shù)檢測三維培養(yǎng)的HGFs整合素α5β1、FAK、p-FAK和COL-Ⅰ的mRNA與蛋白表達變化情況。3、利用整合素α5β1抑制劑(ATN-161)構(gòu)建HGFs的整合素α5β1抑制模型。采用CCK-8技術(shù)檢測不同濃度(0、10nM、100nM、1μM、10μM、100μM、1mM)的ATN-161對細胞增殖活性的影響,作用時間分別是0、24、48、72小時;采用RT-qPCR技術(shù)檢測不同濃度(0、10nM、100nM、1μM、10μM)的ATN-161對HGFs表達整合素α5β1 mRNA的影響情況,作用時間為48小時。4、對PLGA-HGFs復(fù)合體加入濃度為1μM的ATN-161,作用時間分別為0、3、6、12、24、48小時;對PLGA-HGFs復(fù)合體加入濃度為1μM的ATN-161后,施加25g/cm2的靜壓力,作用時間分別為0、3、6、12、24、48小時,采用RT-qPCR和Western blot技術(shù)檢測三維培養(yǎng)的HGFs整合素α5β1、FAK、p-FAK和COL-Ⅰ的mRNA與蛋白表達變化情況。結(jié)果:1、采用組織塊培養(yǎng)法成功培養(yǎng)出原代細胞,經(jīng)傳代純化細胞,性狀穩(wěn)定,取第4-6代HGFs接種于PLGA支架,構(gòu)建PLGA-HGFs三維培養(yǎng)模型。2、對PLGA支架上HGFs施加25 g/cm2的靜壓力后,HGFs整合素α5β1、FAK(p-FAK)和COL-Ⅰ的mRNA和蛋白表達量均上調(diào)。整合素α5β1、FAK的mRNA和蛋白表達量在3-6h時表達量最高,6h后緩慢下降;磷酸化FAK蛋白表達量在12h時表達量達到峰值,12h后逐漸下降,趨于正常值;COL-Ⅰ的mRNA和蛋白表達量均升高,在24h時表達量最高,24h后緩慢下降。與整合素α5β1、FAK相比,COL-Ⅰ的變化反應(yīng)較慢。3、在72h內(nèi),濃度低于或等于10μM時,ATN-161對HGFs增殖活性無明顯影響。濃度高于10μM后,ATN-161對HGFs增殖活性有明顯影響,隨著時間,抑制作用逐漸增強。濃度為1μM的ATN-161對整合素α5β1的抑制作用最為顯著。4、在加入濃度為1μM的ATN-161實驗組中,HGFs的整合素α5β1、FAK(p-FAK)、COL-ⅠmRNA和蛋白表達量均有下降。在PLGA-HGFs復(fù)合體中加入濃度為1μM的ATN-161后,靜壓力作用下HGFs的整合素α5β1、FAK、COL-ⅠmRNA表達量在3h時稍有升高,3h后均降低,且低于對照組;整合素α5β1、FAK、COL-Ⅰ的蛋白水平總體上也均有降低;COL-Ⅰ的蛋白表達量在3-6h時有顯著的升高,6h后逐漸下降。結(jié)論:1、本研究成功構(gòu)建了PLGA-HGFs三維培養(yǎng)及力學(xué)加載模型。2、靜壓力可以促進HGFs整合素α5β1、FAK(p-FAK)和COL-ⅠmRNA與蛋白的表達,整合素α5β1和FAK參與HGFs力學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。3、靜壓力作用下,整合素α5β1感應(yīng)力學(xué)信號,調(diào)控下游FAK的表達和磷酸化水平,影響細胞合成COL-Ⅰ,從而參與細胞外基質(zhì)的纖維化過程。
【學(xué)位單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R783.5
【部分圖文】：

圖 1-1 細胞加力模型圖Fig1-1 The modified “weight” method for loading compressive forceA HGFs 的原代培養(yǎng) ×40 B HGFs 的傳代培養(yǎng) ×40圖 1-2 HGFs 培養(yǎng)Fig1-2 The culture of human gingival fibroblasts

HGFs培養(yǎng)

圖2-1 A：靜壓力對HGFs表達整合素α5 mRNA的影響；B：靜壓力對HGFs表達整合素β1 mRNA的影響；C：靜壓力對 HGFs 表達 FAK mRNA 的影響；D：靜壓力對 HGFs 表達 COL-Ⅰ mRNA 的影響Fig2-1 A: The mRNAexpression of Integrinα5 under compressive force; B:The mRNA expressionof Integrinβ1under compressive force; C:The mRNA expression of FAK under compressiveforce; D: The mRNA expression of COL-Ⅰ under compressive force注：*表示不同加力時間組與未加力組之間比較 P＜0.05。結(jié)果顯示：對 PLGA 支架上 HGFs 施加 25g/cm2的靜壓力后，與未加力組相比，整合素 α5 的 mRNA 表達量在 12 小時內(nèi)均顯示上調(diào)，在 6 小時的表達量最高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05)；在加力 6 小時之后，整合素 α5 的 mRNA 表達量逐漸恢復(fù)至未加力（0 小時）組水平。與未加力組相比，整合素 β1 的 mRNA 表達量在 48 小時內(nèi)均
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本文編號：2856545