研究背景及目的： 口腔粘膜下纖維性變(oral submucous fibrosis, OSF)是一種慢性、隱匿性、具有癌變傾向的口腔粘膜病,癌變率高達(dá)7.6%。最近的流行病學(xué)調(diào)查表明,OSF的發(fā)病地區(qū)、發(fā)病率和癌變率均有上升趨勢(shì)。目前認(rèn)為OSF與咀嚼檳榔、膠原代謝紊亂、免疫、遺傳、微循環(huán)及血液流變學(xué)等因素有關(guān),本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),丹參聯(lián)合小劑量潑尼松龍治療具有明顯的臨床效果,但口腔粘膜下纖維性變的確切發(fā)病機(jī)制及治療顯效獲得的機(jī)制仍不清楚。 miRNA是近年來發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達(dá)的內(nèi)源性非編碼單鏈小RNA分子,參與了機(jī)體生長發(fā)育,器官形成,造血,細(xì)胞增殖、分化及凋亡等眾多生理活動(dòng)和病理過程。近年來miRNA在心肌纖維化、腎臟纖維化和肝纖維化等方面已有許多報(bào)道,至于miRNA在OSF發(fā)病中的功能及機(jī)制研究報(bào)道較少。本研究旨在探討miRNA在OSF發(fā)病及臨床治療轉(zhuǎn)歸中的功能及作用機(jī)制,為闡明OSF的發(fā)病機(jī)理及臨床治療提供新的線索。 研究方法： (1)選取1例臨床上具有典型病理特征的中期OSF組織及其配對(duì)正常組織,以正常組織為對(duì)照,部分病變組織行Affymetrix miRNA芯片實(shí)驗(yàn),建立OSF相關(guān)miRNA表達(dá)譜。原配對(duì)組織及選取的初診OSF配對(duì)中、晚期各10例組織經(jīng)niRNA專用抽提試劑盒抽提miRNA后,經(jīng)專用miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄后,用實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證miRNA芯片結(jié)果。 (2)針對(duì)感興趣的miRNA,根據(jù)下列三個(gè)國際公認(rèn)的、擁有不同計(jì)算方法的數(shù)據(jù)庫：www.targetscan.org、pictar.mdc-berlin.de/cgi-bin/PicTar_vertebrate.cgi、www.mirbase.org進(jìn)行miRNA靶標(biāo)的初步預(yù)測(cè),尋找三個(gè)數(shù)據(jù)庫都預(yù)測(cè)為靶的基因。 (3)從正常口腔粘膜組織獲得原代成纖維細(xì)胞,以檳榔堿(50μg/m1)誘導(dǎo),于72h后檢測(cè)差異miRNA的表達(dá)。原代培養(yǎng)OSF-Fb細(xì)胞,經(jīng)丹參(90mg/ml)聯(lián)合小劑量潑尼松龍作用,于72h后檢測(cè)差異miRNA的表達(dá)。 (4)通過生物信息學(xué)軟件對(duì)miR-203可能調(diào)控的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè),結(jié)合其生物學(xué)功能,篩選出miR-203可能的靶基因COL4A4。Western blot檢測(cè)上述收集的配對(duì)標(biāo)本組織、檳榔堿誘導(dǎo)前后的正�？谇徽衬こ衫w維細(xì)胞及丹參聯(lián)合小劑量潑尼松龍?zhí)幚砬昂蟮腛SF-Fb細(xì)胞中COL4A4的表達(dá)。 (5)將COL4A4基因3'UTR包括miR-203結(jié)合位點(diǎn)、上下游部分側(cè)翼序列以及酶切位點(diǎn)在內(nèi)的共60bp片段分別克隆入pMIR-REPORT熒光素酶報(bào)告基因載體,將其分別與β-gal表達(dá)質(zhì)粒及miR-203表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞24h后檢測(cè)報(bào)告基因活性。結(jié)果： (1)所選病變組織屬于OSF病變中期,miRNA芯片顯示差異1.5倍以上的miRNA共有18個(gè),其中OSF病變組織中上調(diào)12個(gè),下調(diào)6個(gè),miRNA特異性實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證結(jié)果與芯片結(jié)果一致;(2)臨床中、晚期OSF組織中差異miRNA的變化趨勢(shì)與芯片結(jié)果基本一致；(3)生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示其中的miR-203、 miR-23b及miR-200c等可能參與了OSF病變過程及其后的癌變；(4)檳榔堿能誘導(dǎo)正�？谇徽衬こ衫w維細(xì)胞中miRNA的表達(dá)改變,丹參聯(lián)合小劑量潑尼松龍能逆轉(zhuǎn)OSF成纖維細(xì)胞中相關(guān)miRNA的表達(dá)；(5)生物信息預(yù)測(cè)顯示COL4A4基因3'UTR與miR-203之間有一物種間保守作用位點(diǎn)(site1),3個(gè)非保守作用位點(diǎn)(site2, site3, site4);(6)OSF組織中,COL4A4的蛋白表達(dá)量明顯高于配對(duì)正常組織,檳榔堿能誘導(dǎo)上調(diào)正�？谇徽衬こ衫w維細(xì)胞中COL4A4的表達(dá),而丹參聯(lián)合小劑量潑尼松龍能下調(diào)OSF成纖維細(xì)胞中COL4A4的表達(dá);(7)miR-203能明顯抑制site1介導(dǎo)的報(bào)告基因活性,能部分抑制site2與site4介導(dǎo)的報(bào)告基因活性,而對(duì)site3介導(dǎo)的報(bào)告基因活性無明顯影響。 結(jié)論： (1)首次構(gòu)建了OSF相關(guān)的miRNA表達(dá)譜；(2)臨床組織驗(yàn)證提示差異miRNA在OSF的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用；(3)檳榔堿體外能誘導(dǎo)正�？谇徽衬こ衫w維細(xì)胞中miRNA的表達(dá)改變,而丹參聯(lián)合潑尼松龍能逆轉(zhuǎn)OSF成纖維細(xì)胞中相關(guān)miRNA的表達(dá)；(4)miR-203與COL4A4的蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān),miR-203能直接靶向抑制COL4A4的蛋白表達(dá)。
【學(xué)位單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2012
【中圖分類】：R781.5
【文章目錄】：
摘要
Abstract
前言
第一章 口腔粘膜下纖維性變相關(guān)miRNA表達(dá)譜的建立
    1 概論
    2 材料與方法
    3 方法
    4 結(jié)果
    5 討論
第二章 檳榔堿及丹參聯(lián)合小劑量潑尼松龍對(duì)miRNA表達(dá)譜的改變
    1 材料與方法
    2 方法
    3 結(jié)果
    4 討論
第三章 miR-203靶向調(diào)控COL4A4的表達(dá)
    1 引言
    2 材料與方法
    3 結(jié)果
    4 討論
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀傅士學(xué)位期間主要的成果

【參考文獻(xiàn)】

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1 侯杰,蔡后榮,戴令娟;川芎和丹參聯(lián)合潑尼松治療特發(fā)性肺纖維化療效觀察[J];實(shí)用老年醫(yī)學(xué);2001年02期

2 崔燎,鄒麗宜,劉鈺瑜,艾春媚,吳鐵,吳怡;丹參水提物和丹參素促進(jìn)成骨細(xì)胞活性和防治潑尼松所致大鼠骨質(zhì)疏松[J];中國藥理學(xué)通報(bào);2004年03期

3 芷晴;檳榔被認(rèn)定為一級(jí)致癌物[J];先鋒隊(duì);2004年05期

本文編號(hào)：2856495