牙齒的發(fā)生和發(fā)育是由釉質(zhì)形成所需的牙源性上皮細胞和形成牙髓牙本質(zhì)復合體的牙源性間充質(zhì)細胞共同來完成。因此牙齒的再生必須要有兩種細胞:上皮和間充質(zhì)細胞。組織工程化牙齒研究的關鍵在于:獲取來源豐富且具有成牙潛能的種子細胞,使其在適宜的成牙微環(huán)境下發(fā)育、分化。由于牙源性種子細胞的難以獲得,所以尋找合適的的成體干細胞作為種子細胞是再生研究的重要目標。人牙齦成纖維細胞是口腔粘膜牙齦組織的主要細胞,在牙齦、牙周組織的生理和病理中起重要作用。這種細胞來源豐富,有很強的生長和自我繁殖能力。依據(jù)真皮組織干細胞的研究進展情況來看,由于口腔粘膜與皮膚類似所以提示研究者在口腔粘膜中也應該含有類似的成體干細胞存在。因成體干細胞具有可塑性,如能從牙齦固有層中分離出間充質(zhì)干細胞,將非牙源性成體干細胞誘導分化為牙源性細胞,將為組織工程牙齒的構建提供新的種子細胞來源。本研究采用組織塊和胰酶消化法原代培養(yǎng)人牙齦間充質(zhì)干細胞、牙周膜干細胞和真皮干細胞,并對牙齦間充質(zhì)干細胞生物學特性進行鑒定。在此基礎上利用SD大鼠發(fā)育早期的牙胚條件培養(yǎng)液來誘導牙齦間充質(zhì)干細胞向特定方向分化的可能性,探討牙齦間充質(zhì)干細胞向牙源性間充質(zhì)細胞分化的能力。為篩選和誘導組織工程牙齒種子細胞提供研究參考。取得的主要研究結(jié)果如下: 1.牙齦間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)、鑒定及生物學特性的研究 經(jīng)患者/監(jiān)護人同意后取臨床上導萌術或者智齒拔出時切下的牙齦采用組織塊和胰酶消化法進行牙齦間充質(zhì)干細胞原代培養(yǎng)。利用磁珠分選法和有限稀釋法對原代培養(yǎng)的牙齦間充質(zhì)細胞進行篩選純化,將克隆形成的細胞在倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)及生長狀況。對篩選細胞的增殖能力、細胞表型以及細胞周期的特性進行分析。結(jié)果顯示所培養(yǎng)的牙齦間充質(zhì)干細胞的形態(tài)多為長梭形,為典型的成纖維細胞形態(tài)。使用流式細胞儀檢測牙齦間充質(zhì)干細胞表型,結(jié)果顯示對于間充質(zhì)干細胞的標志物CD29、CD90分別有99.8%和99.4%的表達陽性。說明了我們獲取的細胞具有間充質(zhì)干細胞生物學特性。與此同時對于CD34和CD45的低表達也表明我們培養(yǎng)的牙齦纖維來源的間充質(zhì)干細胞為非造血系來源細胞。牙齦間充質(zhì)干細胞具有克隆形成能力,生長狀態(tài)穩(wěn)定,經(jīng)誘導后有成骨和成脂肪能力。流式細胞周期分析顯示所培養(yǎng)的細胞多數(shù)處于G0/G1期。免疫化學檢測間充質(zhì)干細胞標志物CD105、CD146、STOR-1細胞均呈陽性表達;增殖細胞核抗原Ki67,多數(shù)細胞呈陽性且增殖旺盛。由此看來確定所分離細胞為間充質(zhì)干細胞。 2.牙齦固有層間充質(zhì)干細胞與牙周膜、真皮干細胞的生物學特性比較. 為進一步探討牙齦固有層間充質(zhì)干細胞的生物學特性,我們對人牙齦間充質(zhì)干細胞、牙周膜干細胞和真皮干細胞采用組織塊法進行原代培養(yǎng)。繪制生長曲線,測定三者堿性磷酸酶活性;使用流式細胞術檢測三種細胞的表面分子表達、細胞增殖檢測(MTT、細胞周期分析)、多向分化(成脂、成骨)能力檢測、RT-PCR檢測。觀察對比三種細胞其形態(tài)、生長方式、增殖能力等生物學特性的異同。結(jié)果顯示,光鏡下觀察三種細胞在形態(tài)和結(jié)構上相似。牙齦間充質(zhì)干細胞原代培養(yǎng)成功率及細胞增殖能力明顯高于牙周膜干細胞但低于真皮干細胞。流式細胞術在檢測三種干細胞的表面分子CD90、CD105表達中,牙齦間充質(zhì)干細胞表達最高。在PCR檢測中牙周膜干細胞、牙齦間充質(zhì)干細胞的I型膠原表達強于真皮干細胞,Ⅲ型膠原表達牙周膜干細胞最強,真皮干細胞其次,牙齦間充質(zhì)干細胞表達最弱。牙齦間充質(zhì)細胞的ALP水平明顯高于真皮干細胞,但低于牙周膜干細胞。成脂、成骨多向分化能力檢測中牙周膜干細胞牙齦間充質(zhì)干細胞真皮干細胞。結(jié)論:牙周膜干細胞具有較強的成骨能力,是理想的牙齒組織工程的種子細胞。牙齦間充質(zhì)干細胞成脂成骨能力優(yōu)于真皮干細胞易于培養(yǎng)成活,增殖力強,具有牙周膜干細胞的一些特點,也可考慮作為牙齒組織工程的種子細胞。 3.牙胚條件培養(yǎng)基對牙齦間充質(zhì)干細胞牙向分化的體外誘導研究 以牙胚細胞條件培養(yǎng)液為輔助誘導液對牙齦間充質(zhì)干細胞提供成牙微環(huán)境,誘導牙齦間充質(zhì)干細胞進行牙向分化誘導。結(jié)果表明,牙齦間充質(zhì)干細胞經(jīng)過體外一段時間的牙胚條件培養(yǎng)基誘導后,細胞增殖能力變強;牙齦間充質(zhì)干細胞誘導后RT-PCR能夠表達DMP-1、BSP、OPN、ALP。免疫熒光染色顯示牙相關DMP-1。牙胚細胞條件液不僅可上調(diào)牙齦間充質(zhì)干細胞的增殖活性,還可促進其細胞外基質(zhì)的分泌,形成礦化結(jié)節(jié)。該實驗為尋找非牙源性間充質(zhì)細胞替代牙源性間充質(zhì)細胞的研究奠定了實驗基礎。本研究結(jié)果顯示,牙胚條件培養(yǎng)基能夠促使牙齦間充質(zhì)干細胞在體外向牙源性間充質(zhì)細胞方向分化。
【學位單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2010
【中圖分類】：R78
【部分圖文】：

1A、B牙齦間充質(zhì)干細胞原代培養(yǎng)

2.1A-C有限稀釋法獲得單細胞來源人牙齦間充質(zhì)干細胞克隆

2.2D甲苯胺藍對克隆進行染色
【參考文獻】

相關期刊論文 前5條

1 孟憲安;劉景文;郭寧;;中國牙周組織工程進展[J];哈爾濱醫(yī)藥;2005年06期

2 金巖,董蕊;皮膚干細胞的生物學特點與應用研究[J];基礎醫(yī)學與臨床;2005年10期

3 ;Making a tooth:growth factors,transcription factors,and stem cells[J];Cell Research;2005年05期

4 劉宏偉,歐龍,龐勁凡,袁志萍;自體骨髓基質(zhì)細胞用于牙周骨缺損移植的動物實驗研究[J];牙體牙髓牙周病學雜志;2000年03期

5 歐龍,劉宏偉,王東勝,羅蕓,馬良,袁志萍;狗牙周缺損處移植自體骨髓干細胞的骨化實驗觀察[J];中華口腔醫(yī)學雜志;2002年02期

本文編號：2847358