目的:慢性根尖周炎(Chronic apical periodontitis,CAP)作為口腔頜面部最常見的疾病之一,其病理過程主要是炎癥誘導(dǎo)的根尖周牙槽骨組織破壞,是導(dǎo)致牙齒喪失的主要原因。慢性根尖周炎不僅會(huì)引起根尖周骨組織破壞、牙齒喪失,還與一些全身性、系統(tǒng)性疾病的發(fā)生和預(yù)后有關(guān)。誘導(dǎo)成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨組織形成,進(jìn)而修復(fù)缺損的根尖周骨組織,是慢性根尖周病損的治療目標(biāo)。在真核生物的細(xì)胞核中,核心組蛋白與其外包繞的DNA構(gòu)成染色質(zhì)的基本單位-核小體。組蛋白的N末端可以發(fā)生磷酸化、乙�；�、甲基化、泛素化等多種修飾,繼而對(duì)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)以及轉(zhuǎn)錄過程產(chǎn)生影響,從而維持基因轉(zhuǎn)錄程序、決定細(xì)胞命運(yùn)和特性。其中,組蛋白H3第27位賴氨酸殘基三甲基化(Trimethylation of histone H3 lysine 27,H3K27me3)與基因轉(zhuǎn)錄抑制相關(guān)。具有十字形結(jié)構(gòu)域蛋白3(Jumonji domain-containing 3,Jmjd3),別名為賴氨酸特異性去甲基化酶6B(Lysine-specific demethylase6B,KDM6B),是目前已鑒定的作用于組蛋白H3第27位賴氨酸殘基(Histone H3 lysine 27,H3K27)位點(diǎn)的組蛋白去甲基化酶之一。Jmjd3能夠催化H3K27me3發(fā)生去甲基化,從而使基因轉(zhuǎn)錄由抑制變?yōu)榧せ顮顟B(tài)。近年來,Jmjd3調(diào)控的表觀遺傳修飾在調(diào)節(jié)骨代謝方面的作用受到關(guān)注。在線粒體途徑的成骨細(xì)胞內(nèi)源性凋亡過程中,Jmjd3通過調(diào)節(jié)抗凋亡蛋白B細(xì)胞淋巴瘤-2(B cell lymyphoma-2,Bcl-2)的表達(dá)及促凋亡蛋白與B細(xì)胞淋巴瘤-2相互作用的細(xì)胞死亡介質(zhì)(Bcl-2 interacting mediator of cell death,Bim)的磷酸化,抑制成骨細(xì)胞凋亡進(jìn)程。但Jmjd3是否參與到腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞外源性凋亡過程中,以及其具體調(diào)控的機(jī)制,尚未見報(bào)道。腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)既可以通過激活半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶8(cysteine aspartic acid specific protease8,caspase8),發(fā)生級(jí)聯(lián)裂解反應(yīng)活化凋亡蛋白caspase3,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡出現(xiàn),也可以通過抑制腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2(TNF receptor associated factors 2,TRAF2)干擾細(xì)胞程序性死亡,從而激活核轉(zhuǎn)錄因子(Nuclear factor kappaB,NF-κB)和c-JUN氨基末端激酶(c-JUN N-terminal kinase,JNK)信號(hào)通路,促進(jìn)細(xì)胞增殖。當(dāng)TNF-α聯(lián)合放線菌酮(Cycloheximide,CHX)共同作用于細(xì)胞后,CHX能夠抑制促進(jìn)細(xì)胞增殖的信號(hào)通路,并通過死亡受體通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。Ras相關(guān)結(jié)構(gòu)域家族(Ras association domain family,RASSF),由RASSF1-RASSF10十個(gè)成員組成,均包括特色的Ras相關(guān)結(jié)構(gòu)域(Ras-association domain,RA),參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、細(xì)胞遷移和黏附,以及微管穩(wěn)定性等,對(duì)腫瘤的形成有著至關(guān)重要的作用。其中,RASSF5,也被稱為Ras效應(yīng)因子1(Novel Ras effector 1,NORE1),是RASSF家族中唯一具有RA和SARAH(Sav/Rassf/Hippo)結(jié)構(gòu)域的成員。RASSF5通過促進(jìn)腫瘤抑制基因p53和p21的活化,阻斷細(xì)胞RNA和蛋白質(zhì)合成的G1期,從而使細(xì)胞生長(zhǎng)停滯。大量研究表明,RASSF5是死亡受體介導(dǎo)的外源性凋亡通路中重要的促凋亡基因。前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在TNF-α和CHX誘導(dǎo)的外源性成骨細(xì)胞凋亡的過程中,RASSF5與Jmjd3表達(dá)有一定的相關(guān)性,因此,我們推測(cè)RASSF5可能是Jmjd3一個(gè)潛在的靶基因,兩者是否具有靶向作用,RASSF5是否參與TNF-α誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡的調(diào)控,并且在外源性凋亡的過程中發(fā)揮何種作用,尚未見報(bào)道。綜上所述,本研究旨在以小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1為研究對(duì)象,以TNF-α為干預(yù)因素,以組蛋白去甲基化酶Jmjd3及其下游RASSF5為研究靶點(diǎn),探討Jmjd3在TNF-α誘導(dǎo)的外源性成骨細(xì)胞凋亡中的表達(dá)及作用,以期為慢性根尖周炎的骨缺損治療提供新的靶點(diǎn)。研究方法:一、實(shí)驗(yàn)方法1、培養(yǎng)小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1使用α-MEM培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),該培養(yǎng)基中含有10%胎牛血清、1×10~5U/L青霉素及1×10~5 U/L鏈霉素,并將細(xì)胞放置于5%CO_2、37℃、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。以20 ng/mL TNF-α聯(lián)合1μg/mL CHX為刺激因素,誘導(dǎo)MC3T3-E1細(xì)胞凋亡。2、采用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-y1)-2,5-diphenyltetra zolium bromide,MTT)方法檢測(cè)0、10、20、40 ng/mL TNF-α聯(lián)合1μg/mL CHX作用于MC3T3-E1細(xì)胞24 h,對(duì)其細(xì)胞活力的影響;Annexin V-別藻藍(lán)素(Allophycocyanin,APC)/碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)染色后,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)0、20、40 ng/mL TNF-α聯(lián)合1μg/mL CHX作用于MC3T3-E1細(xì)胞24 h,對(duì)其凋亡率的影響。3、采用實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time polymerase chain reaction,Real-time PCR)和蛋白印跡(Western blot)方法檢測(cè)20 ng/mL TNF-α聯(lián)合1μg/mL CHX作用于MC3T3-E1細(xì)胞0、2、4、8 h后,Jmjd3的mRNA水平和蛋白水平變化。4、采用Annexin V-APC/PI染色后,流式細(xì)胞術(shù)法檢測(cè)10μM GSK-J4(組蛋白去甲基化酶Jmjd3活性抑制劑)預(yù)處理2 h,20 ng/mL TNF-α聯(lián)合1μg/mL CHX作用于MC3T3-E1細(xì)胞24 h,對(duì)其凋亡率的影響;采用Western blot檢測(cè)10μM GSK-J4預(yù)處理2 h,20 ng/mL TNF-α聯(lián)合1μg/mL CHX作用于MC3T3-E1細(xì)胞0、4、8 h,細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶(poly-ADP-ribose polymerase,PARP)的裂解水平。5、靶向Jmjd3的shRNA轉(zhuǎn)染MC3T3-E1細(xì)胞,建立Jmjd3低表達(dá)的細(xì)胞系(shJmjd3),非特異性轉(zhuǎn)染用于陰性對(duì)照(shCont)。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率,Real-time PCR和Western blot檢測(cè)在shJmjd3組和shCont組細(xì)胞中,Jmjd3 mRNA和蛋白的表達(dá)水平。6、采用Annexin V-APC/PI染色后,流式細(xì)胞術(shù)法檢測(cè)20 ng/mL TNF-α聯(lián)合1μg/mL CHX作用于shCont組和shJmjd3組細(xì)胞24 h,對(duì)其凋亡率的影響;采用倒置顯微鏡觀察,經(jīng)20 ng/mL TNF-α聯(lián)合1μg/mL CHX作用于shCont組和shJmjd3組細(xì)胞24 h,細(xì)胞形態(tài)的變化;采用caspase3活性檢測(cè)的方法檢測(cè)20 ng/mL TNF-α聯(lián)合1μg/mL CHX作用于shCont組和shJmjd3組細(xì)胞6 h,對(duì)caspase3活性的影響;采用Western blot的方法檢測(cè)20 ng/mL TNF-α聯(lián)合1μg/mL CHX作用于shCont組和shJmjd3組細(xì)胞0、2、4、6、12、24 h后,PARP的裂解水平。7、采用Real-time PCR的方法檢測(cè)20 ng/mL TNF-α聯(lián)合1μg/mL CHX作用于shCont和shJmjd3細(xì)胞0、2、4 h后,Jmjd3和RASSF5 mRNA水平的變化;采用染色質(zhì)免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation,ChIP)的方法檢測(cè)20 ng/mL TNF-α聯(lián)合1μg/mL CHX作用于shCont和shJmjd3細(xì)胞2 h后,RASSF5啟動(dòng)子區(qū)H3K27me3 mRNA相對(duì)表達(dá)量的變化。二、統(tǒng)計(jì)方法每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次,實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Standard Deviation,SD)表示。采用SPSS l7.0軟件建立數(shù)據(jù)庫(kù),單因素方差分析以及Dunnett t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,雙側(cè)P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:一、TNF-α誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡,且與其濃度呈正相關(guān)1、分別采用0、10、20、40 ng/mL TNF-α聯(lián)合1μg/mL CHX作用于MC3T3-E1細(xì)胞24 h,通過MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn),隨著TNF-α濃度的升高,細(xì)胞活力逐漸降低;2、分別采用0、20、40 ng/mL TNF-α聯(lián)合1μg/mL CHX作用于MC3T3-E1細(xì)胞24 h,采用Annexin V-APC/PI染色后,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率發(fā)現(xiàn),隨著TNF-α濃度的升高,細(xì)胞凋亡的比率逐漸增加。結(jié)合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇20 ng/mL TNF-α聯(lián)合1μg/mL CHX作為刺激因素誘導(dǎo)MC3T3-E1細(xì)胞凋亡。二、Jmjd3在TNF-α誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡過程中表達(dá)增加采用20 ng/mL TNF-α聯(lián)合1μg/mL CHX作用于MC3T3-E1細(xì)胞0、2、4、8 h,分別采用Real-time PCR、Western blot檢測(cè)Jmjd3 mRNA、蛋白的表達(dá)量發(fā)現(xiàn),在凋亡發(fā)生的過程中,Jmjd3的表達(dá)量增加。三、抑制Jmjd3活性,降低TNF-α誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡比率1、采用10μM GSK-J4預(yù)處理MC3T3-E1細(xì)胞2 h,20 ng/mL TNF-α聯(lián)合1μg/mL CHX作用24 h后,Annexin V-APC/PI染色,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率發(fā)現(xiàn),經(jīng)GSK-J4預(yù)處理組與TNF-α聯(lián)合CHX處理組相比較,MC3T3-E1細(xì)胞凋亡率降低,GSK-J4處理組與空白對(duì)照組相比較,凋亡率無明顯差異;2、采用10μM GSK-J4預(yù)處理MC3T3-E1細(xì)胞2 h,20 ng/mL TNF-α聯(lián)合1μg/mL CHX作用0、4、8 h后,Western blot檢測(cè)PARP裂解水平發(fā)現(xiàn),經(jīng)GSK-J4預(yù)處理組細(xì)胞PARP裂解水平降低。四、沉默Jmjd3,抑制TNF-α誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的凋亡1、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)靶向Jmjd3的shRNA轉(zhuǎn)染MC3T3-E1細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率,shCont和shJmjd3組細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率均在80%以上;Real-time PCR、Western blot檢測(cè)Jmjd3在shCont和shJmjd3細(xì)胞中mRNA和蛋白的表達(dá)水平,與shCont組相比較,Jmjd3在shJmjd3組細(xì)胞中mRNA的表達(dá)水平降低,蛋白的表達(dá)量降低;2、采用20 ng/mL TNF-α聯(lián)合1μg/mL CHX作用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的shCont和shJmjd3細(xì)胞24 h,Annexin V-APC/PI染色,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,與shCont組相比較,shJmjd3組細(xì)胞的凋亡率降低;3、采用20 ng/mL TNF-α聯(lián)合1μg/mL CHX作用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的shCont和shJmjd3細(xì)胞24 h,倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化發(fā)現(xiàn),與shCont組相比較,shJmjd3組凋亡細(xì)胞的數(shù)量降低;4、采用20 ng/mL TNF-α聯(lián)合1μg/mL CHX作用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的shCont和shJmjd3細(xì)胞6 h,caspase3活性試劑盒染色后,熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),與shCont組相比較,shJmjd3組細(xì)胞caspase3活性較低;5、采用20 ng/mL TNF-α聯(lián)合1μg/mL CHX作用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的shCont和shJmjd3細(xì)胞0、2、4、6、12、24 h,Western blot檢測(cè)PARP裂解水平發(fā)現(xiàn),與shCont組相比較,shJmjd3組細(xì)胞PARP裂解水平降低。五、Jmjd3通過調(diào)節(jié)RASSF5啟動(dòng)子區(qū)域H3K27me3的募集水平調(diào)控RASSF5的表達(dá)1、采用20 ng/mL TNF-α聯(lián)合1μg/mL CHX作用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的shCont和shJmjd3細(xì)胞0、2、4 h,Real-time PCR檢測(cè)Jmjd3和RASSF5的mRNA相對(duì)表達(dá)量發(fā)現(xiàn),兩者表達(dá)趨勢(shì)一致,與shCont組相比較,shJmjd3組細(xì)胞表達(dá)RASSF5水平降低;2、采用20 ng/mL TNF-α聯(lián)合1μg/mL CHX作用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的shCont和shJmjd3細(xì)胞2 h,ChIP結(jié)果表明,與shCont組相比較,shJmjd3組細(xì)胞RASSF5啟動(dòng)子-750/-581和-235/-70區(qū)域H3K27me3的水平明顯增高,-550/-373區(qū)域H3K27me3的水平無明顯差異。結(jié)論:1、抑制Jmjd3活性及沉默Jmjd3后,成骨細(xì)胞凋亡比率降低,說明Jmjd3促進(jìn)TNF-α誘導(dǎo)的外源性成骨細(xì)胞凋亡的發(fā)生;2、沉默Jmjd3降低促凋亡基因RASSF5的表達(dá),增加其啟動(dòng)子區(qū)域H3K27me3的表達(dá),說明Jmjd3可能通過調(diào)控RASSF5啟動(dòng)子區(qū)域去甲基化水平調(diào)控RASSF5的表達(dá),從而調(diào)控TNF-α誘導(dǎo)的外源性成骨細(xì)胞凋亡過程。
【學(xué)位單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R781.341
【部分圖文】：

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果NF-α誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡，且與其濃度呈正相關(guān)TT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，10 ng/mL TNF-α對(duì)細(xì)胞活力的影響不明顯，隨著 T增加，達(dá)到 20 ng/mL 以上時(shí)，細(xì)胞活力明顯降低（圖 1A）。流式細(xì)胞，20 ng/mL、40 ng/mL TNF-α能夠誘導(dǎo) MC3T3-E1 細(xì)胞凋亡，且隨著 T增加凋亡比率增加（圖 1B）。

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文凋亡比率，其中 Annexin V-APC+/PI-、Annexin V-APC+/PI+記 ng/mL TNF-α組相比較。 Jmjd3 在 TNF-α誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡過程中表Real-time PCR 結(jié)果表明，20 ng/mL TNF-α聯(lián)合 1 μg/ 0、2、4、8 h 后，Jmjd3 表達(dá)量增加，并且在 2 htern blot 結(jié)果表明，20 ng/mL TNF-α聯(lián)合 1 μg/mL CHX4、8 h 后，Jmjd3 蛋白表達(dá)量增加（圖 2B）。

非特異性轉(zhuǎn)染用于陰性對(duì)照（shCont），流式細(xì)胞術(shù)確認(rèn) MC3T3-E1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率（圖4A）；Real-time PCR（圖 4B）和 Western blot（圖 4C）明確 Jmjd3 mRNA 和蛋白水平的低表達(dá)；流式細(xì)胞術(shù)（圖 4D）和顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)觀察（圖 4E）結(jié)果均表明，在 20 ng/mL TNF-α聯(lián)合 1 μg/mL CHX 作用下，與 shCont 組相比較，shJmjd3組細(xì)胞凋亡比率降低；caspase3 活性檢測(cè)結(jié)果表明，20 ng/mL TNF-α聯(lián)合 1 μg/mLCHX 作用 6 h，與 shCont 組相比較， shJmjd3 組細(xì)胞活化的 caspase3 含量明顯降低（圖 4F）；Western blot 結(jié)果顯示，20 ng/mL TNF-α和 1 μg/mL CHX 作用 0、2、4、6、12、24 h 后
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2847314