正畸臨床中理想的矯治效果基于矯治器的選擇、治療方案的設(shè)計(jì)以及條件較適宜的牙周組織。正畸牙齒移動過程中的基本理論依據(jù)為壓力側(cè)骨吸收張力側(cè)骨形成,來保持牙齒在牙槽骨中的生理性移動。而此過程中牙槽骨的基本條件和骨改建是牙齒移動的生物學(xué)基礎(chǔ)。然而正畸臨床中經(jīng)常會面臨牙槽骨條件較差的問題,尤其是成年患者,由于其牙槽骨的形成受先天后天因素的影響,經(jīng)�？吹窖啦酃墙M織的吸收、疏松(或致密)、缺損等狀態(tài)。這種牙槽骨組織的缺陷是無法通過矯治器或矯治技術(shù)彌補(bǔ)的,因此不能達(dá)到較好的矯治效果。而且目前正畸臨床和實(shí)驗(yàn)研究中尚沒有針對改善牙槽骨基本條件的治療理念和方法措施。隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展,基因治療已經(jīng)深入到各項(xiàng)領(lǐng)域,在以往的正畸研究中,針對牙齒移動的機(jī)制和影響研究仍限于細(xì)胞分子、蛋白和信號通路水平,而針對分子水平的研究較罕見。micro RNA是一類內(nèi)源性單鏈RNA分子,調(diào)節(jié)人類接近60%的基因和蛋白的表達(dá),是近幾年來靶基因治療的熱門研究。許多研究中均報(bào)道了正畸力作用下micro RNA的基因芯片檢測,micro RNA和機(jī)械力學(xué)可相互作用調(diào)節(jié),對機(jī)械力作用下的骨改建發(fā)揮著精密而必不可少的調(diào)控作用。其中mi R-34a是一類骨代謝方面報(bào)道較多、作用較明確的micro RNA。mi R-34a主要用于癌癥的抑制研究,然而近年來學(xué)者們發(fā)現(xiàn)mi R-34a不僅抑制了各種腫瘤細(xì)胞的增殖、生長和遷移,同時(shí)也顯著抑制了癌癥的骨轉(zhuǎn)移現(xiàn)象,因此近五年來針對mi R-34a參與骨改建的研究逐漸揭開面紗。自2014年Nature的一篇研究報(bào)道了mi R-34a對骨調(diào)控的重要作用,尤其是破骨細(xì)胞,mi R-34a關(guān)于各類骨細(xì)胞、干細(xì)胞的相關(guān)研究逐漸增加起來。mi R-34a不僅是天然的破骨細(xì)胞抑制劑,也對成骨分化的過程進(jìn)行復(fù)雜調(diào)節(jié)作用。此外mi R-34a與軟骨發(fā)育、骨組織修復(fù)反應(yīng)以及牙齒發(fā)育過程的關(guān)系也逐漸被報(bào)道。然而由于micro RNA自身結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性、表面帶負(fù)電荷以及易被核酸酶降解等缺點(diǎn),常需要陽離子聚合物遞送系統(tǒng)進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)。PEI25K是衡量非病毒陽離子聚合物遞送能力的金標(biāo)準(zhǔn),其具有高效轉(zhuǎn)染效率、高度結(jié)合能力、質(zhì)子緩沖能力強(qiáng)等優(yōu)勢,但是卻隱含較大的細(xì)胞毒性的危險(xiǎn)。因此學(xué)者們通過化學(xué)修飾的方法將PEI25K進(jìn)行改性進(jìn)而降低毒性作用。N-Ac-L-Leu-PEI是PEI25K改性后的派生物,其除具有PEI25K良好裝載和轉(zhuǎn)染能力外,尚具有良好的細(xì)胞安全性,降低了PEI25K的毒性。已在國外知名雜志的研究中被報(bào)道。本研究擬應(yīng)用N-Ac-L-Leu-PEI遞送載體實(shí)現(xiàn)mi R-34a的體內(nèi)和體外轉(zhuǎn)染過程。眾所周知,micro RNA發(fā)揮主要調(diào)控作用是通過其與靶向基因的3’端非翻譯區(qū)堿基互補(bǔ)配對結(jié)合進(jìn)而降解或抑制靶基因的表達(dá)。在此我們通過研究mi R-34a介導(dǎo)的正畸力作用下骨改建機(jī)制,來尋找mi R-34a的潛在靶因子。通過機(jī)制和靶因子的研究更有助于我們理解mi R-34a介導(dǎo)正畸力骨改建作用的途徑,以及后期對遞送載體進(jìn)行修飾,嫁接具有靶因子的特殊基團(tuán),進(jìn)而提高mi R-34a作用的特異性,提高效率。根據(jù)以上,我們擬研究mi R-34a在機(jī)械力作用下骨改建過程中的變化情況,以及mi R-34a對機(jī)械力作用下骨改建的影響作用,并探討mi R-34a影響作用的可能機(jī)制。本研究具體內(nèi)容分五部分實(shí)驗(yàn)展開:實(shí)驗(yàn)1正畸牙齒移動中成骨分化與mi R-34a表達(dá)的變化情況采用Wistar大鼠,建立體內(nèi)實(shí)驗(yàn)性牙齒移動模型;提取、培養(yǎng)、誘導(dǎo)大鼠骨髓干細(xì)胞,通過四點(diǎn)彎曲細(xì)胞力學(xué)加載儀建立體外應(yīng)力模型,采用HE染色、免疫組織化學(xué)染色、q RT-PCR、ALP活性、ALP染色、western blot等研究方法,檢測體內(nèi)移動牙齒牙槽骨成骨分化和體外BMSCs在力學(xué)作用下的成骨分化水平,以及在此過程中mi R-34a在體內(nèi)和體外的表達(dá)水平變化情況。實(shí)驗(yàn)2 N-Ac-L-Leu-PEI對mi R-34a遞送能力檢測采用N-Ac-L-Leu-PEI作為micro RNA的遞送系統(tǒng)進(jìn)行研究,并與商業(yè)化Lipofectamine 2000的轉(zhuǎn)染效能進(jìn)行比較,通過表征檢測、凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)、MTT實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡等檢測以及體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率q RT-PCR檢測和生物安全性檢測,評價(jià)N-Ac-L-Leu-PEI對micro RNA的遞送能力與生物安全性。實(shí)驗(yàn)3機(jī)械力作用下mi R-34a對體外大鼠骨髓干細(xì)胞成骨分化的影響作用體外研究mi R-34a對應(yīng)力介導(dǎo)的BMSCs成骨分化影響作用,采用N-Ac-L-Leu-PEI遞送載體進(jìn)行micro RNA轉(zhuǎn)染,通過mi R-34a過表達(dá)和mi R-34a抑制檢測應(yīng)力作用下BMSCs的成骨分化基因和蛋白表達(dá)水平以及ALP活性。實(shí)驗(yàn)4 mi R-34a對大鼠牙齒移動和牙槽骨改建的影響作用體內(nèi)研究mi R-34a對力學(xué)作用下介導(dǎo)的牙槽骨骨改建影響作用,同樣采用N-Ac-L-Leu-PEI遞送載體進(jìn)行體內(nèi)micro RNA局部運(yùn)送,通過q RT-PCR、HE染色、免疫組織化學(xué)染色、micro CT分別檢測mi R-34a過表達(dá)和mi R-34a抑制對力作用下牙齒移動距離、成骨分化基因和蛋白、骨代謝指標(biāo)的影響作用。實(shí)驗(yàn)5探討mi R-34a介導(dǎo)的力學(xué)骨改建初步機(jī)制通過Western blot實(shí)驗(yàn)方法初步探究mi R-34a介導(dǎo)的力學(xué)下成骨分化的機(jī)制,首先檢測張力作用下Wnt/β-catenin信號通路的活化情況;其次應(yīng)用N-Ac-L-Leu-PEI遞送micro RNA至BMSCs,通過mi R-34a過表達(dá)和mi R-34a抑制分別檢測張力作用下Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白的變化情況;最后抑制靶因子后過表達(dá)和抑制mi R-34a,檢測對力作用下Wnt/β-catenin通路蛋白的影響。以闡明mi R-34a介導(dǎo)機(jī)械力作用下骨改建的基本機(jī)制。通過上述5部分實(shí)驗(yàn),得出以下結(jié)果:實(shí)驗(yàn)1成功建立大鼠牙齒移動模型和體外干細(xì)胞力學(xué)加載模型,力作用下可于體內(nèi)的HE染色和免疫組化染色切片內(nèi)發(fā)現(xiàn)較多Runx2陽性細(xì)胞,體內(nèi)和體外Runx2、Col I、ALP基因表達(dá)增加,Runx2和Col I蛋白表達(dá)提高,ALP活性顯著增加。同時(shí)mi R-34a的表達(dá)水平也增高了,在每個(gè)檢測時(shí)間點(diǎn)增高趨勢與成骨分化基因的變化水平同步,且具有時(shí)間依賴性。實(shí)驗(yàn)2 N-Ac-L-Leu-PEI具有較低的粒徑與電位,可與mi R-34a形成納米級混合物(直徑約200nm);質(zhì)量比2:1時(shí)即可完全結(jié)合mi R-34a;N-Ac-L-Leu-PEI轉(zhuǎn)染后細(xì)胞相對增殖度均保持在90%以上,體現(xiàn)良好的生物安全性;N-Ac-L-Leu-PEI具有較高的轉(zhuǎn)染效率,且細(xì)胞安全性和轉(zhuǎn)染效率均高于商品化的Lipofectamine 2000;體內(nèi)研究中,局部注射mi R-34a agomir和antagomir后q RT-PCR結(jié)果顯示組織中mi R-34a的表達(dá)量分別為29倍和0.4倍;體內(nèi)肝功與腎功的生化指標(biāo)正常、心肝脾腎肺組織形態(tài)學(xué)無異常;實(shí)驗(yàn)3 mi R-34a過表達(dá)后可提高力學(xué)作用下Runx2和Col I基因和蛋白水平以及ALP活性。mi R-34a抑制后其作用與mi R-34a過表達(dá)相反。實(shí)驗(yàn)4 mi R-34a過表達(dá)可促進(jìn)牙齒移動過程中牙槽骨成骨分化基因和蛋白(Runx2、Col I、ALP)的表達(dá),骨合成代謝參數(shù)(BV/TV、BMD、Tb.N、Tb.Th)提高,骨分解代謝參數(shù)降低(Tb.Sp),牙齒移動距離減少。mi R-34a抑制后對以上作用表現(xiàn)為相反。實(shí)驗(yàn)5應(yīng)力抑制了GSK-3β蛋白表達(dá)且促進(jìn)了活化β-catenin蛋白的表達(dá),進(jìn)而激活了Wnt/β-catenin信號通路;在加力狀態(tài)下,mi R-34a過表達(dá)可抑制GSK-3β的表達(dá),激活β-catenin蛋白的活化,促進(jìn)Wnt/β-catenin信號通路釋放,mi R-34a抑制后對GSK-3β和β-catenin蛋白的表達(dá)作用相反;基因軟件預(yù)測和熒光素酶檢測顯示mi R-34a的靶基因?yàn)镚SK-3β;將GSK-3β基因抑制后,mi R-34a對以上力學(xué)作用下Wnt/β-catenin信號通路蛋白的調(diào)控作用喪失。通過以上實(shí)驗(yàn),可以得出以下結(jié)論:1.體內(nèi)和體外研究均證明機(jī)械力促進(jìn)了成骨分化和骨形成作用,而此過程中mi R-34a的表達(dá)顯著提高,且呈時(shí)間依賴性;2.N-Ac-L-Leu-PEI可與mi R-34a形成穩(wěn)定復(fù)合物,實(shí)現(xiàn)體內(nèi)和體外安全、高效的遞送,保證mi R-34a發(fā)揮生物作用;3.在體外研究中,mi R-34a可促進(jìn)牽張力作用下的成骨分化作用;4.在體內(nèi)研究中,mi R-34a通過促進(jìn)移動牙齒周圍牙槽骨的骨形成作用,減低牙齒移動距離;5.在機(jī)制研究中,我們發(fā)現(xiàn)機(jī)力激活了Wnt/β-catenin信號通路,mi R-34a可通過靶向作用GSK-3β來激活Wnt/β-catenin信號通路。
【學(xué)位單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R783.5
【部分圖文】：

吉林大學(xué)博士學(xué)位論文1.1.2 方法1.1.2.1 大鼠正畸牙齒移動模型建立按照 King[111]的實(shí)驗(yàn)方法建立大鼠正畸牙齒移動模型，如圖 2.1 所示。應(yīng)用戊巴比妥鈉（6 μl/g）行大鼠腹腔注射麻醉，麻醉成功后，將大鼠仰臥固定于手術(shù)臺上，牽拉上頜前牙固定于手術(shù)臺打開大鼠口腔。用高速渦輪車針在大鼠右側(cè)第一磨牙和前牙的齦緣水平處做一淺凹，用 0.20mm 正畸結(jié)扎絲結(jié)扎，在兩牙之間置正畸螺旋彈簧，牽拉彈簧，應(yīng)用正畸 ZL-1 型測力計(jì)使彈簧產(chǎn)生 50g 力值，將彈簧固定結(jié)扎。左側(cè)不放置加力裝置作為對照組。大鼠蘇醒后常規(guī)飼養(yǎng)。每天檢查裝置，如果脫離及時(shí)更換。

吉林大學(xué)博士學(xué)位論文浸泡過夜，雙蒸水沖洗 10 遍，75%酒精浸泡消毒過夜，三蒸水沖洗干凈，烘干，無菌超凈臺內(nèi)紫外燈雙面照射 6 小時(shí)以上。取第三代 BMSCs 按 5×105/板接種于加力板的中心 5cm×3.6cm 區(qū)域，24 小時(shí)后細(xì)胞貼壁，加入含成骨誘導(dǎo)液的 L-DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)液，進(jìn)行力學(xué)加載，每日2 小時(shí)牽張力，連續(xù)加載 3 天、5 天、7 天。對照組不加力。參照 Li[178]的實(shí)驗(yàn)方法，采用四點(diǎn)彎曲細(xì)胞力學(xué)加載儀對實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞施加周期性、單軸向張應(yīng)力，指標(biāo)設(shè)置為 0.5Hz、1mm（相當(dāng)于 2000με）、2 小時(shí)。如圖 2.2 所示。

吉林大學(xué)博士學(xué)位論文11. 二抗（1:3000）封閉,80 轉(zhuǎn)/分，室溫?fù)u晃 1 小時(shí)；12. TBST 洗膜，80-90 轉(zhuǎn)/分，10 分鐘/次，3 次；用 ECL 化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒中試劑 A 和試劑 B 各 1ml 混勻后，滴加在 PVDF膜上，放入儀器內(nèi)檢測。1.1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理本研究數(shù)據(jù)均應(yīng)用 SPSS 19.0 軟件系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,所得結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（χ ±S）表示。各組間數(shù)據(jù)比較采用方差分析及配對 t 檢驗(yàn)，雙側(cè)檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05，p 值：* p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001，與空白對照組比較。1.2 結(jié)果1.2.1 大鼠正畸移動牙齒周圍組織學(xué)檢測
【參考文獻(xiàn)】

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1 李書琴;楊珊;任嬡姝;戴紅衛(wèi);;張應(yīng)力刺激下Wnt/β-catenin信號通路對成牙骨質(zhì)細(xì)胞Runx2表達(dá)調(diào)控的體外研究[J];華西口腔醫(yī)學(xué)雜志;2015年01期

2 Juan Xu;Bo Yu;Christine Hong;Cun-Yu Wang;;KDM6B epigenetically regulates odontogenic differentiation of dental mesenchymal stem cells[J];International Journal of Oral Science;2013年04期

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2 侯建華;EphrinB2/EphB4信號介導(dǎo)正畸牙移動壓力區(qū)骨改建的實(shí)驗(yàn)研究[D];吉林大學(xué);2014年

本文編號：2842207