正畸臨床中理想的矯治效果基于矯治器的選擇、治療方案的設計以及條件較適宜的牙周組織。正畸牙齒移動過程中的基本理論依據為壓力側骨吸收張力側骨形成,來保持牙齒在牙槽骨中的生理性移動。而此過程中牙槽骨的基本條件和骨改建是牙齒移動的生物學基礎。然而正畸臨床中經常會面臨牙槽骨條件較差的問題,尤其是成年患者,由于其牙槽骨的形成受先天后天因素的影響,經�？吹窖啦酃墙M織的吸收、疏松(或致密)、缺損等狀態(tài)。這種牙槽骨組織的缺陷是無法通過矯治器或矯治技術彌補的,因此不能達到較好的矯治效果。而且目前正畸臨床和實驗研究中尚沒有針對改善牙槽骨基本條件的治療理念和方法措施。隨著生物技術的飛速發(fā)展,基因治療已經深入到各項領域,在以往的正畸研究中,針對牙齒移動的機制和影響研究仍限于細胞分子、蛋白和信號通路水平,而針對分子水平的研究較罕見。micro RNA是一類內源性單鏈RNA分子,調節(jié)人類接近60%的基因和蛋白的表達,是近幾年來靶基因治療的熱門研究。許多研究中均報道了正畸力作用下micro RNA的基因芯片檢測,micro RNA和機械力學可相互作用調節(jié),對機械力作用下的骨改建發(fā)揮著精密而必不可少的調控作用。其中mi R-34a是一類骨代謝方面報道較多、作用較明確的micro RNA。mi R-34a主要用于癌癥的抑制研究,然而近年來學者們發(fā)現mi R-34a不僅抑制了各種腫瘤細胞的增殖、生長和遷移,同時也顯著抑制了癌癥的骨轉移現象,因此近五年來針對mi R-34a參與骨改建的研究逐漸揭開面紗。自2014年Nature的一篇研究報道了mi R-34a對骨調控的重要作用,尤其是破骨細胞,mi R-34a關于各類骨細胞、干細胞的相關研究逐漸增加起來。mi R-34a不僅是天然的破骨細胞抑制劑,也對成骨分化的過程進行復雜調節(jié)作用。此外mi R-34a與軟骨發(fā)育、骨組織修復反應以及牙齒發(fā)育過程的關系也逐漸被報道。然而由于micro RNA自身結構的不穩(wěn)定性、表面帶負電荷以及易被核酸酶降解等缺點,常需要陽離子聚合物遞送系統(tǒng)進行轉運。PEI25K是衡量非病毒陽離子聚合物遞送能力的金標準,其具有高效轉染效率、高度結合能力、質子緩沖能力強等優(yōu)勢,但是卻隱含較大的細胞毒性的危險。因此學者們通過化學修飾的方法將PEI25K進行改性進而降低毒性作用。N-Ac-L-Leu-PEI是PEI25K改性后的派生物,其除具有PEI25K良好裝載和轉染能力外,尚具有良好的細胞安全性,降低了PEI25K的毒性。已在國外知名雜志的研究中被報道。本研究擬應用N-Ac-L-Leu-PEI遞送載體實現mi R-34a的體內和體外轉染過程。眾所周知,micro RNA發(fā)揮主要調控作用是通過其與靶向基因的3’端非翻譯區(qū)堿基互補配對結合進而降解或抑制靶基因的表達。在此我們通過研究mi R-34a介導的正畸力作用下骨改建機制,來尋找mi R-34a的潛在靶因子。通過機制和靶因子的研究更有助于我們理解mi R-34a介導正畸力骨改建作用的途徑,以及后期對遞送載體進行修飾,嫁接具有靶因子的特殊基團,進而提高mi R-34a作用的特異性,提高效率。根據以上,我們擬研究mi R-34a在機械力作用下骨改建過程中的變化情況,以及mi R-34a對機械力作用下骨改建的影響作用,并探討mi R-34a影響作用的可能機制。本研究具體內容分五部分實驗展開:實驗1正畸牙齒移動中成骨分化與mi R-34a表達的變化情況采用Wistar大鼠,建立體內實驗性牙齒移動模型;提取、培養(yǎng)、誘導大鼠骨髓干細胞,通過四點彎曲細胞力學加載儀建立體外應力模型,采用HE染色、免疫組織化學染色、q RT-PCR、ALP活性、ALP染色、western blot等研究方法,檢測體內移動牙齒牙槽骨成骨分化和體外BMSCs在力學作用下的成骨分化水平,以及在此過程中mi R-34a在體內和體外的表達水平變化情況。實驗2 N-Ac-L-Leu-PEI對mi R-34a遞送能力檢測采用N-Ac-L-Leu-PEI作為micro RNA的遞送系統(tǒng)進行研究,并與商業(yè)化Lipofectamine 2000的轉染效能進行比較,通過表征檢測、凝膠阻滯實驗、MTT實驗、流式細胞儀和熒光顯微鏡等檢測以及體內轉染效率q RT-PCR檢測和生物安全性檢測,評價N-Ac-L-Leu-PEI對micro RNA的遞送能力與生物安全性。實驗3機械力作用下mi R-34a對體外大鼠骨髓干細胞成骨分化的影響作用體外研究mi R-34a對應力介導的BMSCs成骨分化影響作用,采用N-Ac-L-Leu-PEI遞送載體進行micro RNA轉染,通過mi R-34a過表達和mi R-34a抑制檢測應力作用下BMSCs的成骨分化基因和蛋白表達水平以及ALP活性。實驗4 mi R-34a對大鼠牙齒移動和牙槽骨改建的影響作用體內研究mi R-34a對力學作用下介導的牙槽骨骨改建影響作用,同樣采用N-Ac-L-Leu-PEI遞送載體進行體內micro RNA局部運送,通過q RT-PCR、HE染色、免疫組織化學染色、micro CT分別檢測mi R-34a過表達和mi R-34a抑制對力作用下牙齒移動距離、成骨分化基因和蛋白、骨代謝指標的影響作用。實驗5探討mi R-34a介導的力學骨改建初步機制通過Western blot實驗方法初步探究mi R-34a介導的力學下成骨分化的機制,首先檢測張力作用下Wnt/β-catenin信號通路的活化情況;其次應用N-Ac-L-Leu-PEI遞送micro RNA至BMSCs,通過mi R-34a過表達和mi R-34a抑制分別檢測張力作用下Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白的變化情況;最后抑制靶因子后過表達和抑制mi R-34a,檢測對力作用下Wnt/β-catenin通路蛋白的影響。以闡明mi R-34a介導機械力作用下骨改建的基本機制。通過上述5部分實驗,得出以下結果:實驗1成功建立大鼠牙齒移動模型和體外干細胞力學加載模型,力作用下可于體內的HE染色和免疫組化染色切片內發(fā)現較多Runx2陽性細胞,體內和體外Runx2、Col I、ALP基因表達增加,Runx2和Col I蛋白表達提高,ALP活性顯著增加。同時mi R-34a的表達水平也增高了,在每個檢測時間點增高趨勢與成骨分化基因的變化水平同步,且具有時間依賴性。實驗2 N-Ac-L-Leu-PEI具有較低的粒徑與電位,可與mi R-34a形成納米級混合物(直徑約200nm);質量比2:1時即可完全結合mi R-34a;N-Ac-L-Leu-PEI轉染后細胞相對增殖度均保持在90%以上,體現良好的生物安全性;N-Ac-L-Leu-PEI具有較高的轉染效率,且細胞安全性和轉染效率均高于商品化的Lipofectamine 2000;體內研究中,局部注射mi R-34a agomir和antagomir后q RT-PCR結果顯示組織中mi R-34a的表達量分別為29倍和0.4倍;體內肝功與腎功的生化指標正常、心肝脾腎肺組織形態(tài)學無異常;實驗3 mi R-34a過表達后可提高力學作用下Runx2和Col I基因和蛋白水平以及ALP活性。mi R-34a抑制后其作用與mi R-34a過表達相反。實驗4 mi R-34a過表達可促進牙齒移動過程中牙槽骨成骨分化基因和蛋白(Runx2、Col I、ALP)的表達,骨合成代謝參數(BV/TV、BMD、Tb.N、Tb.Th)提高,骨分解代謝參數降低(Tb.Sp),牙齒移動距離減少。mi R-34a抑制后對以上作用表現為相反。實驗5應力抑制了GSK-3β蛋白表達且促進了活化β-catenin蛋白的表達,進而激活了Wnt/β-catenin信號通路;在加力狀態(tài)下,mi R-34a過表達可抑制GSK-3β的表達,激活β-catenin蛋白的活化,促進Wnt/β-catenin信號通路釋放,mi R-34a抑制后對GSK-3β和β-catenin蛋白的表達作用相反;基因軟件預測和熒光素酶檢測顯示mi R-34a的靶基因為GSK-3β;將GSK-3β基因抑制后,mi R-34a對以上力學作用下Wnt/β-catenin信號通路蛋白的調控作用喪失。通過以上實驗,可以得出以下結論:1.體內和體外研究均證明機械力促進了成骨分化和骨形成作用,而此過程中mi R-34a的表達顯著提高,且呈時間依賴性;2.N-Ac-L-Leu-PEI可與mi R-34a形成穩(wěn)定復合物,實現體內和體外安全、高效的遞送,保證mi R-34a發(fā)揮生物作用;3.在體外研究中,mi R-34a可促進牽張力作用下的成骨分化作用;4.在體內研究中,mi R-34a通過促進移動牙齒周圍牙槽骨的骨形成作用,減低牙齒移動距離;5.在機制研究中,我們發(fā)現機力激活了Wnt/β-catenin信號通路,mi R-34a可通過靶向作用GSK-3β來激活Wnt/β-catenin信號通路。
【學位單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R783.5
【部分圖文】：

吉林大學博士學位論文1.1.2 方法1.1.2.1 大鼠正畸牙齒移動模型建立按照 King[111]的實驗方法建立大鼠正畸牙齒移動模型，如圖 2.1 所示。應用戊巴比妥鈉（6 μl/g）行大鼠腹腔注射麻醉，麻醉成功后，將大鼠仰臥固定于手術臺上，牽拉上頜前牙固定于手術臺打開大鼠口腔。用高速渦輪車針在大鼠右側第一磨牙和前牙的齦緣水平處做一淺凹，用 0.20mm 正畸結扎絲結扎，在兩牙之間置正畸螺旋彈簧，牽拉彈簧，應用正畸 ZL-1 型測力計使彈簧產生 50g 力值，將彈簧固定結扎。左側不放置加力裝置作為對照組。大鼠蘇醒后常規(guī)飼養(yǎng)。每天檢查裝置，如果脫離及時更換。

吉林大學博士學位論文浸泡過夜，雙蒸水沖洗 10 遍，75%酒精浸泡消毒過夜，三蒸水沖洗干凈，烘干，無菌超凈臺內紫外燈雙面照射 6 小時以上。取第三代 BMSCs 按 5×105/板接種于加力板的中心 5cm×3.6cm 區(qū)域，24 小時后細胞貼壁，加入含成骨誘導液的 L-DMEM 細胞培養(yǎng)液，進行力學加載，每日2 小時牽張力，連續(xù)加載 3 天、5 天、7 天。對照組不加力。參照 Li[178]的實驗方法，采用四點彎曲細胞力學加載儀對實驗組細胞施加周期性、單軸向張應力，指標設置為 0.5Hz、1mm（相當于 2000με）、2 小時。如圖 2.2 所示。

吉林大學博士學位論文11. 二抗（1:3000）封閉,80 轉/分，室溫搖晃 1 小時；12. TBST 洗膜，80-90 轉/分，10 分鐘/次，3 次；用 ECL 化學發(fā)光顯色試劑盒中試劑 A 和試劑 B 各 1ml 混勻后，滴加在 PVDF膜上，放入儀器內檢測。1.1.2.9 統(tǒng)計學處理本研究數據均應用 SPSS 19.0 軟件系統(tǒng)進行統(tǒng)計學分析,所得結果均以均數±標準差（χ ±S）表示。各組間數據比較采用方差分析及配對 t 檢驗，雙側檢驗水準為α=0.05，p 值：* p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001，與空白對照組比較。1.2 結果1.2.1 大鼠正畸移動牙齒周圍組織學檢測
【參考文獻】

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1 李書琴;楊珊;任嬡姝;戴紅衛(wèi);;張應力刺激下Wnt/β-catenin信號通路對成牙骨質細胞Runx2表達調控的體外研究[J];華西口腔醫(yī)學雜志;2015年01期

2 Juan Xu;Bo Yu;Christine Hong;Cun-Yu Wang;;KDM6B epigenetically regulates odontogenic differentiation of dental mesenchymal stem cells[J];International Journal of Oral Science;2013年04期

3 ;Cell biology in orthodontic tooth movement:The known and the unknown[J];上海口腔醫(yī)學;2005年02期

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1 丁小博;以PEI衍生物為載體構建腫瘤基因遞送體系：從小分子到大分子的修飾[D];吉林大學;2015年

2 侯建華;EphrinB2/EphB4信號介導正畸牙移動壓力區(qū)骨改建的實驗研究[D];吉林大學;2014年

本文編號：2842207