牙周疾病作為人類口腔發(fā)生率較高的疾病之一,與齲病統(tǒng)稱為人類兩大口腔疾病。侵襲性牙周炎(aggressive periodontitis,AgP)是一類發(fā)病年齡早、病程進(jìn)展快、破壞程度大、有家族聚集性的牙周疾病。AgP的發(fā)病因素多樣,發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。越來越多的證據(jù)表明,人類牙周疾病牙周支持組織的破壞過程中,結(jié)締組織的降解和牙槽骨的破壞主要是通過誘導(dǎo)活化宿主細(xì)胞酶來實(shí)現(xiàn)的。基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子-1(tissue inhibitors of metalloroteinases-1, TIMP-1)在牙周疾病中的作用近年來引起眾多學(xué)者的關(guān)注。該組蛋白水解酶主要通過對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)中大分子降解作用的調(diào)節(jié),參與人體眾多正常的生理過程和病理過程。MMPs與TIMP-1在正常的牙周組織中保持平衡,參與牙周組織的改建。而當(dāng)在某些刺激因子或炎癥的作用下,會(huì)引起MMPs發(fā)生過度分泌或其活性被激活,導(dǎo)致MMPs與TIMP-1的比例超出正常所在范圍。研究表明MMPs及TIMPs的失衡可能是激活細(xì)胞外基質(zhì)、基底膜細(xì)胞過度降解的重要原因,從而導(dǎo)致牙周軟組織和牙槽骨組織膠原的破壞與喪失,進(jìn)一步導(dǎo)致牙周疾病的發(fā)生 間質(zhì)膠原酶(collagenases)是MMPs的第一大類,主要成員包括MMP-1、 MMP-8和MMP-13。其中MMP-1又被稱為成纖維細(xì)胞型膠原酶(fibroblast collagenase, FIB-CL),主要來源于成纖維細(xì)胞、吞噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞等,優(yōu)先降解Ⅲ型膠原。有研究認(rèn)為MMP-1是局限型侵襲性牙周炎中參與牙周組織破壞的膠原酶,尤其是對(duì)膠原降解的始動(dòng)作用。MMP-8又被稱為中性粒細(xì)胞型膠原酶(neutrophil collagenase, PMN-CL),是目前有關(guān)炎性牙周組織和齦溝液中MMPs表達(dá)研究中最多的一種,主要由多形核中性粒細(xì)胞產(chǎn)生和分泌,MMP-8主要參與Ⅰ型膠原纖維的破壞,而Ⅰ型纖維膠原又是牙周膜和牙槽骨組織的主要膠原組成成份。MMP-13是上皮組織中首要表達(dá)的膠原酶,且在多種牙周組織和細(xì)胞中表達(dá),與組織中膠原纖維的快速轉(zhuǎn)變密切相關(guān),MMP-13對(duì)Ⅱ型膠原酶的活性較其他膠原酶更具影響力。TIMP-1是MMPs的內(nèi)源性抑制因子,可以和大多數(shù)MMP結(jié)合,被認(rèn)為是MMPs的重要內(nèi)源性抑制因子之一。 近年來,大量研究表明膠原酶及TIMP-1水平及活性與慢性牙周炎關(guān)系密切,但有關(guān)膠原酶及TIMP-1水平在亞洲人群AgP患者中的研究尚未見報(bào)道。 目的： 本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)MMP-1、MMP-8、MMP-13及TIMP-1在侵襲性牙周炎牙齦組織中的表達(dá),與牙周臨床指標(biāo)相結(jié)合,了解MMPs及TIMP-1與AgP牙周炎癥程度的相關(guān)關(guān)系,并將MMPs及TIMP-1比值作為新的指標(biāo)進(jìn)行分析,進(jìn)一步分析MMPs及TIMP-1的平衡在AgP發(fā)展中的作用。 方法： 1.病例選擇。實(shí)驗(yàn)組：選擇來自廣東省口腔醫(yī)院牙周科和番禺分院牙周科就診的30例侵襲性牙周炎患者(平均年齡29.37歲)。診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)1999年國(guó)際研討會(huì)牙周病分類法提出的標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)照組：選擇來自廣東省口腔醫(yī)院外科就診的因阻生齒、錯(cuò)位牙、埋伏牙而需要拔牙的20例牙周健康者(平均年齡26.35歲),所有患者無全身性疾病,6個(gè)月內(nèi)未服用抗生素,未經(jīng)任何牙周治療等,并簽署知情同意書。 2.樣本采集。對(duì)納入患者在其治療前采用Florida探針進(jìn)行全口牙齒的探查和記錄。記錄指標(biāo)包括菌斑指數(shù)、探診深度、出血指數(shù)、附著喪失,松動(dòng)度以及根分叉病變,牙周炎患者拍攝全口根尖片。在符合侵襲性牙周炎標(biāo)準(zhǔn)不能保留牙齒拔除過程中獲得牙齦標(biāo)本,對(duì)照組在阻生牙等拔除術(shù)中采集牙齦標(biāo)本。蒸餾水沖洗后,置于4%多聚甲醛中固定12～24h。 3.免疫組織化學(xué)檢測(cè)。對(duì)固定樣本行脫水,透明,石蠟包埋,制成3um的連續(xù)切片,采用多聚賴氨酸防脫片,60℃烤片2h。行MMP-1、MMP-8、MMP-13及TIMP-1常規(guī)免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)。 4.對(duì)上述免疫組織化學(xué)結(jié)果進(jìn)行定位及半定量分析。陽性細(xì)胞為細(xì)胞漿染色呈黃褐色的細(xì)胞。在x400倍光鏡下,每張切片隨機(jī)選擇10個(gè)有陽性細(xì)胞表達(dá)的視野拍攝,IPP (Image Pro Plus)圖片分析測(cè)量軟件分析。根據(jù)得到的IOD (Integrated option density)值除以目標(biāo)分布區(qū)域面積,得到MMP-1、MMP-8、MMP-13及TIMP-1的平均光密度值,并計(jì)算MMP-1/TIMP-1、MMP-8/TIMP-1、 MMP-13/TIMP-1比值。 (5)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)進(jìn)行分析,計(jì)量資料結(jié)果用描述性分析結(jié)果,如x±s表示,各項(xiàng)指標(biāo)經(jīng)正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn)后,對(duì)兩組臨床指標(biāo)及TIMP-1、MMP-1、MMP-8、MMP-13表達(dá)情況及MMP-1/TIMP-1、 MMP-8/TIMP-1、MMP-13/TIMP-1比值進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)或兩獨(dú)立樣本非參數(shù)秩和檢驗(yàn)。采用Spearman法進(jìn)行相關(guān)分析,并繪制ROC曲線。檢驗(yàn)水準(zhǔn)均以a=0.05。 結(jié)果： 1. TIMP-1、MMP-1、MMP-8和MMP-13在牙齦組織中的表達(dá)和分布。①健康的牙齦組織中。TIMP-1在上皮層和固有層中均可觀察到胞漿呈黃褐色的陽性細(xì)胞；主要分布區(qū)域是結(jié)締組織區(qū)。MMP-1呈弱表達(dá),在上皮細(xì)胞和固有層細(xì)胞中可見散在的陽性細(xì)胞,且在上皮層內(nèi)的表達(dá)呈從棘細(xì)胞淺層到棘細(xì)胞深層染色強(qiáng)度遞減趨勢(shì)。MMP-8和MMP-13在上皮層和固有層中呈弱表達(dá),主要分布區(qū)域?yàn)榻Y(jié)締組織區(qū)。②AgP組牙齦組織中。TIMP-1呈弱表達(dá),主要表達(dá)部位在炎性結(jié)締組織區(qū)；與牙齦健康組相比,差異無顯著意義(P0.05)。MMP-1和MMP-8呈強(qiáng)陽性表達(dá),上皮層和固有層中呈現(xiàn)大量密集的胞漿為黃褐色的陽性細(xì)胞,主要分布在固有層中炎性細(xì)胞密集區(qū),與牙齦健康組相比,差異有顯著性意義(P0.05)。MMP-13呈強(qiáng)陽性表達(dá),上皮層和固有層中大量陽性細(xì)胞分布,主要表達(dá)部位在炎性細(xì)胞浸潤(rùn)區(qū),與牙齦健康組相比,差異無顯著性意義(P0.05)。 2.臨床指標(biāo)和實(shí)驗(yàn)指標(biāo)間的相關(guān)關(guān)系。AgP組中MMPs及其與TIMP-1相應(yīng)的比值與臨床指標(biāo)間存在著一定的相關(guān)關(guān)系。MMP-1、MMP-8、MMP-1/TIMP-1及MMP-8/TIMP-1與PD和AL均存在顯著的相關(guān)關(guān)系(P0.05), MMP-1、 MMP-8、MMP-13、MMP-1/TIMP-1及MMP-8/TIMP-1與BOP存在顯著的相關(guān)關(guān)系(P0.05)。說明MMPs與TIMPs及其比值與AgP的牙周炎癥程度密切相關(guān),隨著炎癥的加重,MMPs與TIMPs的失衡比也加大。各MMPs之間也存在一定的相關(guān)性：MMP-1與MMP-8、MMP-1與MMP-13及MMP-8與MMP-13之間存在顯著的相關(guān)關(guān)系(P0.05),提示MMPs及TIMP-1的平衡可能在AgP發(fā)展中起有重要作用。 (3)把MMPs與TIMP-1的比值作為新因素進(jìn)行分析。根據(jù)ROC曲線分析,AUC(MMP-8/TIMP-1)=0.947AUC(MMP-8)=0.752, AUC(MMP-1/TIMP-1)=0.870AUC(MMP-1)=0.835, MMPs與TIMP-1的比值的運(yùn)用,可以大大提高ROC曲線下的面積值A(chǔ)UC,并依據(jù)ROC曲線標(biāo)準(zhǔn),提示MMP-8/TIMP-1、 MMP-1/TIMP-1、MMP-1和MMP8指標(biāo)可能是AgP牙周組織破壞和炎癥程度的客觀指標(biāo)。 結(jié)論： 1. MMP-1、MMP-8、MMP-13三種膠原酶及TIMP-1可能參與了牙周組織的正常和病理改建過程。 2.本實(shí)驗(yàn)通過把MMP-1、MMP-8和MMP-13與TIMP-1的比值作為新因素來分析,發(fā)現(xiàn)其意義要遠(yuǎn)大于MMP-1、MMP-8和MMP-13單獨(dú)作為影響因素來分析時(shí)的意義,為AgP病理機(jī)制的研究提供了新的角度和思路。
【學(xué)位單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2013
【中圖分類】：R781.42
【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
前言
材料與方法
    1.研究對(duì)象的選擇
    2.全口牙周狀況的檢查和臨床指標(biāo)的記錄
    3.組織標(biāo)本的制備
    4.主要試劑
    5.免疫組織化學(xué)步驟
    6.結(jié)果判定
    7.ImagePro Plus (IPP)計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)
    8.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
結(jié)果
討論
全文小結(jié)
參考文獻(xiàn)
在讀期間研究成果
綜述
    參考文獻(xiàn)
致謝

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