發(fā)布時間：2020-10-11 00:04

　　 研究目的:轉(zhuǎn)錄因子Sox2在胚胎干細胞的自我更新和全能性的維持中起著重要作用,并參與多種組織和器官的形成,而Sox2是否參與腭的發(fā)育及其機制并不清楚,本文的研究目的:(1)檢測轉(zhuǎn)錄因子Sox2在小鼠腭發(fā)育過程中的時空表達特征;(2)以構(gòu)建條件性Sox2基因敲除小鼠為實驗研究模型,進一步研究和探討Sox2在小鼠腭發(fā)育中的生物學(xué)功能。研究方法:(1)首先利用免疫組織化學(xué)技術(shù)(IHC),檢測Sox2蛋白在小鼠腭不同發(fā)育時期的表達特征,并進行觀察和分析;(2)然后構(gòu)建Shh-cre,Sox2fl/fl識條件性敲除小鼠為研究模型,分別通過體視顯微鏡,掃描電鏡(SEM),蘇木素-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining,HE染色),免疫組織化學(xué)技術(shù)(Immunohistochemistry,IHC),EdU 增殖標(biāo)記,凋亡染色(TUNEL)以及實時熒光定量PCR(RT-PCR)等,探討Sox2在腭發(fā)育中的生物學(xué)功能及分子機制。研究結(jié)果:(1)胚胎E11.5天至出生后PN0天,Sox2蛋白在口腔上皮,包括腭上皮和舌上皮中均有強烈的表達。腭突從上頜突中長出(E11.5天),并在口腔中沿著舌兩側(cè)垂直生長(E12.5-E13.5天),在腭前和腭后兩個位置,Sox2在腭上皮、舌上皮中都有強烈的表達;隨后(E14.5天),腭突上抬至舌背部,隨著腭突在水平方向上的繼續(xù)生長,Sox2在腭突前部的表達逐漸減少;兩側(cè)腭突相互接觸、融合(E14.75天),最終中縫上皮消失(E15.5天),在腭中縫上皮中檢測不到Sox2的表達,而在舌上皮中Sox2的表達始終存在。(2)Shh-cre,Sox2fl/fl條件性敲除小鼠與同窩出生的野生型(Sox2fl/fl)小鼠相比較:Sox2基因在腭上皮中被部分敲除,在舌上皮中完全被敲除,表現(xiàn)為嚴(yán)重的繼發(fā)腭腭裂,舌的形態(tài)異常并且與下頜骨黏連,在出生當(dāng)天就死亡,但是,其正側(cè)面觀與野生型小鼠相比無明顯差異。(3)E14.5-E15.5天,野生型(Sox2fl/fl)小鼠兩側(cè)腭突同時上抬至舌背部,并在水平方向上繼續(xù)生長,接著與對側(cè)腭突接觸、融合;而Shh-cre，Sox2fl/fl條件性敲除小鼠表現(xiàn)為一側(cè)腭突上抬,在水平方向上生長,但另一側(cè)腭突不能上抬,繼續(xù)在舌的一側(cè)垂直生長。E14.5天時,EdU增殖標(biāo)記實驗表明,突變型(Shh-cre,Sox2fl/fl)小鼠上抬側(cè)腭突與野生型(Sox2fl/fl)小鼠相比較,無論是腭上皮還是間充質(zhì),細胞增殖能力未見明顯差異;非上抬側(cè)腭突與野生型(Sox2fl/fl)小鼠相比較,腭上皮的細胞增殖能力下降,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),而腭間充質(zhì)的細胞增殖能力無明顯異常。TUNEL凋亡細胞染色實驗顯示,突變型(Shh-cre,Sox22fl/fl)小鼠的非上抬側(cè)腭突和上抬側(cè)腭突與野生型(Sox2fl/fl)小鼠相比較,均無明顯差異。(4)RT-PCR結(jié)果:E14.5天時,在突變型小鼠的上抬側(cè)腭突中,Fgf10、Shh、Fgf8、Pax9、Osr2等基因的表達量明顯下調(diào),但是Bmp4、Msx1的表達水平顯著上調(diào);在非上抬側(cè)腭突中,Bmp4、Fgf10、Shh、Fgf8、Pax9、Osr2等基因的表達量明顯下調(diào),但是Msx1的表達呈顯著上調(diào)趨勢,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:(1)轉(zhuǎn)錄因子Sox2在小鼠腭發(fā)育過程中的表達模式具有時空特異性,提示Sox2可能參與小鼠的腭發(fā)育過程。(2)Shh-creSox2fl/fl條件性敲除小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的繼發(fā)腭腭裂,提示Sox2基因在腭發(fā)育過程中具有重要生物學(xué)功能。(3)Shh-creSox2fl/fl條件性敲除小鼠出現(xiàn)腭裂的可能原因是:A.腭上皮細胞增殖能力下降B.舌發(fā)育異常(舌與下頜黏連)。(4)Shh-cre,Sox2fl/fl 條件性敲除小鼠腭發(fā)育相關(guān)基因表達水平的變化表明,無論是上抬側(cè)還是非上抬側(cè)腭突,腭發(fā)育相關(guān)基因均受到影響。
【學(xué)位單位】：濱州醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R78
【部分圖文】：

２．３．２?小鼠月咢形態(tài)觀察結(jié)果??體視顯微鏡下，Ｅ１５．５天和ＰＮ０天，突變型小鼠和野生型小鼠的側(cè)面觀（圖２－２?ａ－ｄ）、??正面觀（圖２－２ｅ－ｈ）均無明顯差異；口內(nèi)觀（圖２－２ｉ－ｌ，ｍ－ｑ），Ｅ１５．５天－ＰＮ０天時，野??生型小鼠原發(fā)聘與繼發(fā)腭己經(jīng)融合，形成完整的腭部，而５＾－ｃｒｅ，?５ｂｘ／Ｍ、鼠出現(xiàn)嚴(yán)重??的繼發(fā)腭腭裂（圖２－２ｊ，丨），并且舌頭與下頜黏連在一起（圖２－２ｍ?ｑ紅色星號）。Ｅ１６．５??天時，矢狀位切片ＨＥ染色結(jié)果顯示，５ｂｘＷ小鼠出刪ｆ裂（圖２－２ｒ，?ｓ）并且??舌與下頜黏連（圖２－２ｎ?ｓ紅框）。掃描電鏡結(jié)果顯示，Ｅ１５．５天－ＰＮ０天，ＳｂｘＭ小鼠有??清晰并且對稱的ｒｕｇａｅ?（圖２－２?），而小鼠腭表面凹凸不平（圖２－２ｕ，?ｖ??紅框及黃框）。??３１??

濱州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文??２．３．３免疫組化驗證＆ｘ２基因的敲除效率??Ｅ１４．７５天時，５ｂｘ２在小鼠腭上皮及舌上皮均有強烈的表達（圖２－３ａ，ｄ，?ｈ，??ｋ），包括腭中縫上皮（圖２－３ａ，ｈ）；然而在幼／７－ｃｒｅ，?Ｓｏｘｆ小鼠腭上皮中部分表達，在??舌上皮中完全不表達（圖２－３?ｈ，ｋ）。??ｗｔ?＼?ｒ—ｙ?？？??＾?ｖ?．?ｉ?％??ｍｔ??ｈ?－＝?－－－?－??，ａ?ｉ??ｈ；囉議ｒ??圖２－３?＆ｘ２在＆ｊｃ２＃小鼠中的表達??Ｆｉｇｎｒｅ２－３?Ｓｏｘ２?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｉｎ?Ｓｈｈ－ｃｒｅ，?Ｓｏｘ＾１１１?ｍｉｃｅ??Ｅ１４．７５天時，＊Ｓａｃ２在５＾，小鼠腭上皮和舌上皮中表達，而在猶－〇＾?Ｓａｖ＾小鼠腭上皮部分表達，在舌上皮中??檢測不到Ｓａｒ２的表達。ｂ，ｃ，?ｉ，ｊ分別對應(yīng)相應(yīng)時期腭、舌上皮的局部放大。ｐ：腭；ｔ：舌；紅框：腭上皮；藍框：舌??上皮；ＷＴ：?ｗｉｌｄ?ｔｙｐｅ

學(xué)意義（Ｐ＜０．０５）；然而，間充質(zhì)的細胞增殖率無明顯變化（圖２－５－３）。同時，突變型小??鼠上抬側(cè)腭突與野生型小鼠相比較，無論是上皮細胞還是間充質(zhì)細胞，增殖細胞的數(shù)量??在前后軸上均無顯著差異（圖２－５４）。??■Ｉ??１?ｍｕａｕ??■■■■??■■■■??？?■■■■??＾??＾?Ｉ?—??■■■■??圖２－５－１?Ｅ１３．５天和Ｅ１４．５天，野生型小鼠和幼小鼠腭突細胞ＥｄＵ分析??Ｆｉｇｕｒｅ２－５－ｌ?Ｅｄｌｉ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?Ｅｌ?３．５?ａｎｄ?Ｅ１４．５?ｐａｌａｔａｌ?ｓｈｅｌｖｅｓ?ｉｎ?ｗｉｌｄ?ｔｙｐｅ?ａｎｄ?Ｓｈｈ－ｃｒｅ，?Ｓａｖ＾?ｍｉｃｅ??（ａ，?ｂ，?ｅ，ｆ）和（ｃ，?ｄ，ｇ，?ｈ）分別是野牛型�。桑珊屯蛔冃托∈螅咆常堤旌停牛桑矗堤鞎r，在聘前后軸ｌ?ｉＫＭ狀位切??片，（ｉ－ｑ）足?ＤＡＰ丨染色，（ｉ’Ｋｉ’）足?ＥｄＵ?染色，（ｉ”＜）足前兩者的合成。ＷＴ：?ｗｉｌｄｔ＞ｐｅ：?ＭＴ：?ｍｕｔａｎｔ，標(biāo)尺：（ａ－ｈ｝２ｍｍ，??（ｉ－ｑ．?ｒ－ｉ＼＼?ｒ－ｑ＾）?２００＾ｎｉ??３５??
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本文編號：2835740