口腔癌是全世界范圍第六常見的惡性腫瘤,超過90%的口腔癌為口腔鱗狀細(xì)胞癌(Oral Squamous Cell Carcinoma,OSCC),近20年來,OSCC 的5年生存率沒有顯著提高,仍低于50%。諸多學(xué)者都認(rèn)為,在分子生物學(xué)和分子病理學(xué)水平上研究OSCC的發(fā)病機制及抗腫瘤藥物的作用機制能為OSCC的治療提供新思路。近些年來,BRD4蛋白抑制劑作為一種較新的具有抗癌作用的藥物進入人們視野。JQ1作為具有代表性的BRD4蛋白抑制劑,具有抑制OSCC細(xì)胞活性的作用,但關(guān)于其作用機制尚不明確。microRNA作為一種非編碼小RNA,可以在分子水平上調(diào)控基因的表達。因此,為了探尋JQ1的抑癌機制,我們計劃由miRNA入手,將JQ1處理前后的舌鱗癌細(xì)胞系Cal27細(xì)胞進行miRNA高通量測序分析,得出前后表達顯著改變的mi-RNA及其靶基因,并進行進一步研究,主要包括以下方面。第一部分JQ1可以抑制Cal27細(xì)胞的活性目的:為檢測實驗采用的Cal27細(xì)胞對JQ1的敏感性如何,探究JQ1使用后多久發(fā)揮作用,確定適合進行進一步檢測的時間,為后續(xù)實驗做準(zhǔn)備。方法:先將Cal27細(xì)胞接種于6孔板培育48h,分為三組,分別采用0μM、1μM、5μM的JQ1進行處理,在處理后第1、2、3、4天用CCK8檢測腫瘤細(xì)胞的活性。再通過Western-blot評估BRD4的蛋白表達水平。結(jié)果:JQ1能抑制Cal27的細(xì)胞活性,當(dāng)JQ1濃度為5μM時,第4天時細(xì)胞活性約為對照組的44.11%,差異顯著(p0.01)。5μM的JQ1作用第4天時,其BRD4表達與對照組有顯著性差異(p0.01)。結(jié)論:JQ1可以抑制Cal27細(xì)胞活性;我們選擇使用被JQ1(5μM)作用4天的Cal27細(xì)胞作為后續(xù)送檢的實驗組。第二部分高通量測序檢測篩選出miR-191-3p目的:探究在JQ1治療Cal27細(xì)胞時,有哪些miRNA發(fā)生改變;其中改變最顯著的有哪些;并預(yù)測其靶蛋白。方法:將Cal27細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中,實驗組細(xì)胞使用5μM的JQ1處理,對照組不處理,培養(yǎng)4天后,提取總RNA。通過高通量技術(shù)HiSeq 2500(銳博)對兩組RNA進行miRNA測序。通過TargetScan、miRTarBase、miRWalk預(yù)測目的miRNA的靶蛋白。結(jié)果:測序發(fā)現(xiàn)兩組間多個基因表達有顯著差異,其中miR-191-3p表達量log2(fold change)較對照組上調(diào)約8倍,變化最為顯著(p0.01)。多個軟件分析得出mir-191-3p的靶基因,選出其中與腫瘤相關(guān)的基因PTK6。結(jié)論:miR-191-3p表達改變最為顯著,并選定靶蛋白PTK6進行研究。第三部分miR-191-3p上調(diào)引起Cal27細(xì)胞PTK6表達下降目的:驗證miR-191-3p在鱗癌細(xì)胞系中對原癌基因PTK6有調(diào)控作用。方法:將Cal27細(xì)胞接種于6孔板培育48h,分為四組,使用轉(zhuǎn)染的方式分別轉(zhuǎn)染miR-191-3p的mimic、inhibitor、陰性對照及不做處理,用Western-blot檢測48小時后各組細(xì)胞表達PTK6蛋白的量。再通過PCR評估PTK6的基因表達水平。結(jié)果:Western-blot結(jié)果顯示:mimic組的PTK6蛋白表達量較inhibitor組明顯偏低(p0.01);qRT-PCR進一步證實了這結(jié)果。結(jié)論:在Cal27細(xì)胞中,上調(diào)miR-191-3p會引起PTK6蛋白的表達下降。第四部分JQ1藥物作用于Cal27引起PTK6下調(diào)目的:探究在Cal27細(xì)胞中加入JQ1是否會引起PTK6表達下降。方法:將Cal27細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿培育,分為三組,分別為JQ1(1μM)、JQ1(5μM)加藥組和對照組,處理后第4天提取蛋白,Western-blot檢測兩組PTK6蛋白表達情況。結(jié)果:Western-blot結(jié)果顯示JQ1(1μM)和JQ1(5μM)加藥組較對照組的PTK6蛋白表達量明顯下降(p0.01,p0.001)。結(jié)論:JQ1可以使Ca127細(xì)胞中PTK6蛋白表達下降。經(jīng)過以上研究,最終可以得出結(jié)論:JQ1能引起Cal27細(xì)胞內(nèi)大量miRNA表達量發(fā)生改變,特別是通過上調(diào)miR-191-3p,可引起PTK6蛋白的表達下降;此外,JQ1可通過多種信號通路使細(xì)胞中PTK6蛋白表達下降,發(fā)揮抑制腫瘤生長作用。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R739.86
【部分圖文】：

山東大學(xué)碩士學(xué)位論文??天時，ＪＱ１?５＾Ｍ組的ＢＲＤ４蛋白表達進一步降低。而ＪＱ１?ｌ＾Ｍ組較對照組的ＢＲＤ４??蛋白表達無顯著差異（ｐ＞〇．〇５）。這證明了在高濃度ＪＱｌ?（５＾ｉＭ）的治療下，Ｃａｌ２７??細(xì)胞的ＢＲＤ４表達會受到較明顯的抑制，且在第３天ＪＱ１?５ｐＭ組的治療效果就??已經(jīng)較明顯。??

?＾??ｆｏｌｄ?ｃｈａｎｇｅ（ｌｏｇ２）??圖２－２?（Ａ）經(jīng)高通量檢測ＪＱｌ組與對照組表達量具有顯著性差異（／？＜０．０１）的ｍｉＲＮＡ?（縱??軸），以及ＪＱ１組相對于對照組的表達量改變倍數(shù)的ｌ〇ｇ２指數(shù)（橫軸）。（Ｂ）經(jīng)高通量??檢測ＪＱ１組與對照組表達量有顯著性差異（ｐ＜０．０５）的ｍｉＲＮＡ?（縱軸）

圖４－ｌ?（Ａ）采用購得的ｓｉＲＮＡ轉(zhuǎn)染Ｃａｌ２７細(xì)胞系，分別為ｍｉＲ－１９１－３ｐ的ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ組組和ＮＣ組，于轉(zhuǎn)染后７２ｈ檢測各組ＰＴＫ６蛋白的表達水平以及（Ｂ）采用ＲＴ－ｑＰＣＲｍＲＮＡ轉(zhuǎn)錄水平。（Ｃ）在Ｃａｌ２７細(xì)胞中加入不含ｓｉＲＮＡ的轉(zhuǎn)染試劑進行處理，作組，７２ｈ?檢測?ＰＴＫ６?表達量，與?ｃｏｎｔｒｏｌ?組、ＮＣ?組進行比較。＊ｐ＜０．０５；?＊＊ｐ＜０．０１；?＊＊＊／？＜３．ＣＣＫ８結(jié)果??檢測了?ｃｏｎｔｒｏｌ?組、ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ?組、ｍｉｍｉｃ?組、Ｍｏｃｋ?組和?ＮＣ?組在第?１２ｈ２ｄ、３ｄ的Ｃａｌ２７細(xì)胞的增殖能力，結(jié)果可見，ｍｉｍｉｃ組細(xì)胞增殖能力受到抑制，而其他四組均呈上升趨勢。第三天ｍｉｍｉｃ組細(xì)胞增殖能力較ｉｎｈｉｂｉｔｏ著降低（／？＜〇．〇１），而較Ｍｏｃｋ組、ＮＣ組則也有降低，但差異不顯著。組、ＮＣ組二者水平接近，無顯著差異。ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ組細(xì)胞增殖能力高于其他與ｃｏｎｔｒｏ丨組接近。??３－２??２?０?ＮＣ??
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本文編號：2835478