口腔癌是全世界范圍第六常見(jiàn)的惡性腫瘤,超過(guò)90%的口腔癌為口腔鱗狀細(xì)胞癌(Oral Squamous Cell Carcinoma,OSCC),近20年來(lái),OSCC 的5年生存率沒(méi)有顯著提高,仍低于50%。諸多學(xué)者都認(rèn)為,在分子生物學(xué)和分子病理學(xué)水平上研究OSCC的發(fā)病機(jī)制及抗腫瘤藥物的作用機(jī)制能為OSCC的治療提供新思路。近些年來(lái),BRD4蛋白抑制劑作為一種較新的具有抗癌作用的藥物進(jìn)入人們視野。JQ1作為具有代表性的BRD4蛋白抑制劑,具有抑制OSCC細(xì)胞活性的作用,但關(guān)于其作用機(jī)制尚不明確。microRNA作為一種非編碼小RNA,可以在分子水平上調(diào)控基因的表達(dá)。因此,為了探尋JQ1的抑癌機(jī)制,我們計(jì)劃由miRNA入手,將JQ1處理前后的舌鱗癌細(xì)胞系Cal27細(xì)胞進(jìn)行miRNA高通量測(cè)序分析,得出前后表達(dá)顯著改變的mi-RNA及其靶基因,并進(jìn)行進(jìn)一步研究,主要包括以下方面。第一部分JQ1可以抑制Cal27細(xì)胞的活性目的:為檢測(cè)實(shí)驗(yàn)采用的Cal27細(xì)胞對(duì)JQ1的敏感性如何,探究JQ1使用后多久發(fā)揮作用,確定適合進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè)的時(shí)間,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。方法:先將Cal27細(xì)胞接種于6孔板培育48h,分為三組,分別采用0μM、1μM、5μM的JQ1進(jìn)行處理,在處理后第1、2、3、4天用CCK8檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的活性。再通過(guò)Western-blot評(píng)估BRD4的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果:JQ1能抑制Cal27的細(xì)胞活性,當(dāng)JQ1濃度為5μM時(shí),第4天時(shí)細(xì)胞活性約為對(duì)照組的44.11%,差異顯著(p0.01)。5μM的JQ1作用第4天時(shí),其BRD4表達(dá)與對(duì)照組有顯著性差異(p0.01)。結(jié)論:JQ1可以抑制Cal27細(xì)胞活性;我們選擇使用被JQ1(5μM)作用4天的Cal27細(xì)胞作為后續(xù)送檢的實(shí)驗(yàn)組。第二部分高通量測(cè)序檢測(cè)篩選出miR-191-3p目的:探究在JQ1治療Cal27細(xì)胞時(shí),有哪些miRNA發(fā)生改變;其中改變最顯著的有哪些;并預(yù)測(cè)其靶蛋白。方法:將Cal27細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞使用5μM的JQ1處理,對(duì)照組不處理,培養(yǎng)4天后,提取總RNA。通過(guò)高通量技術(shù)HiSeq 2500(銳博)對(duì)兩組RNA進(jìn)行miRNA測(cè)序。通過(guò)TargetScan、miRTarBase、miRWalk預(yù)測(cè)目的miRNA的靶蛋白。結(jié)果:測(cè)序發(fā)現(xiàn)兩組間多個(gè)基因表達(dá)有顯著差異,其中miR-191-3p表達(dá)量log2(fold change)較對(duì)照組上調(diào)約8倍,變化最為顯著(p0.01)。多個(gè)軟件分析得出mir-191-3p的靶基因,選出其中與腫瘤相關(guān)的基因PTK6。結(jié)論:miR-191-3p表達(dá)改變最為顯著,并選定靶蛋白PTK6進(jìn)行研究。第三部分miR-191-3p上調(diào)引起Cal27細(xì)胞PTK6表達(dá)下降目的:驗(yàn)證miR-191-3p在鱗癌細(xì)胞系中對(duì)原癌基因PTK6有調(diào)控作用。方法:將Cal27細(xì)胞接種于6孔板培育48h,分為四組,使用轉(zhuǎn)染的方式分別轉(zhuǎn)染miR-191-3p的mimic、inhibitor、陰性對(duì)照及不做處理,用Western-blot檢測(cè)48小時(shí)后各組細(xì)胞表達(dá)PTK6蛋白的量。再通過(guò)PCR評(píng)估PTK6的基因表達(dá)水平。結(jié)果:Western-blot結(jié)果顯示:mimic組的PTK6蛋白表達(dá)量較inhibitor組明顯偏低(p0.01);qRT-PCR進(jìn)一步證實(shí)了這結(jié)果。結(jié)論:在Cal27細(xì)胞中,上調(diào)miR-191-3p會(huì)引起PTK6蛋白的表達(dá)下降。第四部分JQ1藥物作用于Cal27引起PTK6下調(diào)目的:探究在Cal27細(xì)胞中加入JQ1是否會(huì)引起PTK6表達(dá)下降。方法:將Cal27細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿培育,分為三組,分別為JQ1(1μM)、JQ1(5μM)加藥組和對(duì)照組,處理后第4天提取蛋白,Western-blot檢測(cè)兩組PTK6蛋白表達(dá)情況。結(jié)果:Western-blot結(jié)果顯示JQ1(1μM)和JQ1(5μM)加藥組較對(duì)照組的PTK6蛋白表達(dá)量明顯下降(p0.01,p0.001)。結(jié)論:JQ1可以使Ca127細(xì)胞中PTK6蛋白表達(dá)下降。經(jīng)過(guò)以上研究,最終可以得出結(jié)論:JQ1能引起Cal27細(xì)胞內(nèi)大量miRNA表達(dá)量發(fā)生改變,特別是通過(guò)上調(diào)miR-191-3p,可引起PTK6蛋白的表達(dá)下降;此外,JQ1可通過(guò)多種信號(hào)通路使細(xì)胞中PTK6蛋白表達(dá)下降,發(fā)揮抑制腫瘤生長(zhǎng)作用。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類(lèi)】：R739.86
【部分圖文】：

山東大學(xué)碩士學(xué)位論文??天時(shí)，ＪＱ１?５＾Ｍ組的ＢＲＤ４蛋白表達(dá)進(jìn)一步降低。而ＪＱ１?ｌ＾Ｍ組較對(duì)照組的ＢＲＤ４??蛋白表達(dá)無(wú)顯著差異（ｐ＞〇．〇５）。這證明了在高濃度ＪＱｌ?（５＾ｉＭ）的治療下，Ｃａｌ２７??細(xì)胞的ＢＲＤ４表達(dá)會(huì)受到較明顯的抑制，且在第３天ＪＱ１?５ｐＭ組的治療效果就??已經(jīng)較明顯。??

?＾??ｆｏｌｄ?ｃｈａｎｇｅ（ｌｏｇ２）??圖２－２?（Ａ）經(jīng)高通量檢測(cè)ＪＱｌ組與對(duì)照組表達(dá)量具有顯著性差異（／？＜０．０１）的ｍｉＲＮＡ?（縱??軸），以及ＪＱ１組相對(duì)于對(duì)照組的表達(dá)量改變倍數(shù)的ｌ〇ｇ２指數(shù)（橫軸）。（Ｂ）經(jīng)高通量??檢測(cè)ＪＱ１組與對(duì)照組表達(dá)量有顯著性差異（ｐ＜０．０５）的ｍｉＲＮＡ?（縱軸）

圖４－ｌ?（Ａ）采用購(gòu)得的ｓｉＲＮＡ轉(zhuǎn)染Ｃａｌ２７細(xì)胞系，分別為ｍｉＲ－１９１－３ｐ的ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ組組和ＮＣ組，于轉(zhuǎn)染后７２ｈ檢測(cè)各組ＰＴＫ６蛋白的表達(dá)水平以及（Ｂ）采用ＲＴ－ｑＰＣＲｍＲＮＡ轉(zhuǎn)錄水平。（Ｃ）在Ｃａｌ２７細(xì)胞中加入不含ｓｉＲＮＡ的轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行處理，作組，７２ｈ?檢測(cè)?ＰＴＫ６?表達(dá)量，與?ｃｏｎｔｒｏｌ?組、ＮＣ?組進(jìn)行比較。＊ｐ＜０．０５；?＊＊ｐ＜０．０１；?＊＊＊／？＜３．ＣＣＫ８結(jié)果??檢測(cè)了?ｃｏｎｔｒｏｌ?組、ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ?組、ｍｉｍｉｃ?組、Ｍｏｃｋ?組和?ＮＣ?組在第?１２ｈ２ｄ、３ｄ的Ｃａｌ２７細(xì)胞的增殖能力，結(jié)果可見(jiàn)，ｍｉｍｉｃ組細(xì)胞增殖能力受到抑制，而其他四組均呈上升趨勢(shì)。第三天ｍｉｍｉｃ組細(xì)胞增殖能力較ｉｎｈｉｂｉｔｏ著降低（／？＜〇．〇１），而較Ｍｏｃｋ組、ＮＣ組則也有降低，但差異不顯著。組、ＮＣ組二者水平接近，無(wú)顯著差異。ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ組細(xì)胞增殖能力高于其他與ｃｏｎｔｒｏ丨組接近。??３－２??２?０?ＮＣ??
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