背景先天性缺牙是人類(lèi)常見(jiàn)的牙齒發(fā)育異常性疾病之一,其發(fā)病率約為1.6～20%,多發(fā)生于第三磨牙,其次為第二前磨牙和側(cè)切牙。按是否伴發(fā)系統(tǒng)性疾病,可分為綜合征和非綜合征兩種類(lèi)型。臨床上較為常見(jiàn)的為個(gè)別牙缺失(小于6顆),稱(chēng)為牙齒發(fā)育不全(hypodontia,OMIM 106600,以下均不包括第三磨牙)。當(dāng)缺牙數(shù)目大于6顆時(shí),稱(chēng)為少牙畸形(oligodontia,OMIM 604625),它在白種人中的發(fā)病率約為1.1%,可以單獨(dú)發(fā)病,也可以和其他系統(tǒng)性疾病伴發(fā)。全口無(wú)牙較為少見(jiàn),它通常是綜合征的臨床表現(xiàn)之一。目前的研究表明,有家族史的少牙畸形呈單基因病的特點(diǎn),可表現(xiàn)為常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳和X連鎖遺傳。該病有兩個(gè)較為明確的致病基因,分別是定位于染色體4p16.1～16.3的MSX1 (msh homeobox 1)基因和定位于染色體14q12～13的PAX9(paired box 9)基因,它們均編碼轉(zhuǎn)錄因子,在牙齒發(fā)育過(guò)程中起調(diào)控作用。1996年,Vastardis等首先發(fā)現(xiàn)MSX1基因突變?cè)斐闪巳祟?lèi)牙齒的選擇性缺失;2000年,Stockton等報(bào)道了第一個(gè)PAX9基因突變與大量磨牙先天性缺失相關(guān)。迄今為止,與先天性缺牙相關(guān)的MSX1和PAX9基因突變已經(jīng)達(dá)20多個(gè)(http://www.hgmd.org/)。基因型-表型相關(guān)性分析表明, MSX1基因突變家系的臨床表現(xiàn)包括非綜合征型和綜合征型,唇腭裂為常常合并出現(xiàn)的畸形,累及的牙齒以第二前磨牙和第三磨牙為主;PAX9基因突變的家系主要表現(xiàn)為非綜合征型,以磨牙缺失較為常見(jiàn)。隨著分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的不斷進(jìn)步,對(duì)人類(lèi)遺傳性疾病的研究更加深入。目前,在先天性缺牙的遺傳學(xué)研究領(lǐng)域,多數(shù)是基于家系以進(jìn)行候選基因的突變篩選研究,其數(shù)據(jù)大多來(lái)自歐美,突變多集中于MSX1和PAX9基因。先天性缺牙在中國(guó)人中的發(fā)病率較高,但是相關(guān)的遺傳學(xué)研究進(jìn)展較少,因此收集更多的家系篩選基因突變,并進(jìn)行基因型-表型分析,對(duì)于提高中國(guó)人先天性缺牙的認(rèn)識(shí)具有非常重要的意義。 目的分析一個(gè)中國(guó)漢族非綜合征型少牙畸形家系的臨床及遺傳特征,并檢測(cè)基因突變情況,為正確理解先天性缺牙的遺傳學(xué)發(fā)病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法收集先天性缺牙家系,設(shè)計(jì)調(diào)查表,調(diào)查家系家族史等資料;對(duì)家系成員進(jìn)行全身檢查和口腔專(zhuān)科檢查,拍攝曲面斷層片;分析家系的臨床資料,總結(jié)其臨床特征;同時(shí)整理家族史等資料,繪制系譜圖,做遺傳特征分析;在知情同意的前提下,抽取先證者和部分家系成員的外周血標(biāo)本,提取全血基因組DNA;針對(duì)PAX9和MSX1基因設(shè)計(jì)特異性的引物,采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)結(jié)合DNA直接雙向測(cè)序的方法,檢測(cè)了該家系中7例患者及7例表型正常者和100例無(wú)親緣關(guān)系健康個(gè)體的基因突變;查閱CBM和Pubmed比對(duì)信息,排除多態(tài)性,以確認(rèn)突變;應(yīng)用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)突變對(duì)功能的影響。 結(jié)果該家系表現(xiàn)為常染色體顯性遺傳,且該病在家系中外顯率較高。家系患者的臨床特征為非綜合征型多數(shù)牙缺失、牙齒形態(tài)發(fā)育異常和牙齒異位、間隙及牙合關(guān)系異常,牙齒缺失以第二前磨牙和第三磨牙為主。基因檢測(cè)結(jié)果顯示,MSX1基因的內(nèi)含子1的3’上游2bp處存在一個(gè)新的替代突變IVS1-2AG (451AG),使內(nèi)含子1的剪切受體位點(diǎn)發(fā)生改變。該突變未在家系內(nèi)正常人及無(wú)親緣關(guān)系的健康對(duì)照中出現(xiàn)。對(duì)PAX9基因的檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)異常序列。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,該突變使MSX1基因正常的剪切位點(diǎn)消失,突變可能引起了蛋白質(zhì)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)變化。 結(jié)論 1.該家系為常染色體顯性遺傳; 2.家系內(nèi)患者的臨床特征以第二前磨牙及第三磨牙先天缺失較為常見(jiàn); 3.中國(guó)人MSX1基因突變可引起家族性少牙畸形,IVS1-2AG為一個(gè)新的突變; 4.該突變擴(kuò)大了先天性缺牙的基因突變譜,為進(jìn)一步理解先天性缺牙的遺傳學(xué)發(fā)病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2008
【中圖分類(lèi)】：R781
【部分圖文】：

加入 100μlDNA 溶解液，65℃水浴 1 小時(shí)使 DNA 充分溶解。 將 DNA 溶液置于 4℃保存?zhèn)溆谩?1.3 基因組 DNA 的備份保存及模板 DNA 的配制：用分光光度計(jì)測(cè) DNA 原液的純度和濃度，并分裝成 2～3 管，一份放至 箱保存，剩余的放至 20℃和 4℃保存以做 DNA 檢測(cè)分析。根據(jù) DNA 原液濃度配成濃度為 50ng/μl 的模板 DNA。.2 MSX1 和 PAX9 基因引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì)及用 Primer5.0 軟件自行設(shè)計(jì)擴(kuò)增 MSX1 和 PAX9 基因編碼翼區(qū)域的引物。.2.1 MSX1 和 PAX9 基因的序列獲取在NCBI的網(wǎng)頁(yè)（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）輸入該基因的名稱(chēng)，可得到因的mRNA序列（圖1）。

圖2 Human BLAT Search界面Fig 2 The interface of Human BLAT Search 采用Primer 5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)據(jù)基因mRNA序列與基因組序列的Human BLAT Search的結(jié)果，采用引Primer 5.0，將含有外顯子及外顯子/內(nèi)含子交界處的基因組序列輸入件中（圖3）。根據(jù)序列長(zhǎng)短、合適的起始及終止位置限定設(shè)計(jì)條件，中挑選合適的引物�？紤]到測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性和測(cè)序儀器的誤差，以?xún)?nèi)含子交界50個(gè)堿基以?xún)?nèi)序列可能影響mRNA剪切，一般要超出目標(biāo)序100bp左右。物設(shè)計(jì)主要針對(duì)基因的編碼區(qū)及其側(cè)翼區(qū)域進(jìn)行，設(shè)計(jì)參照以下原則物的長(zhǎng)度控制在16～24 bp。

圖3 Primer5.0引物設(shè)計(jì)界面Fig 3 The interface of Primer 5.0表 1 MSX1 基因的引物序列Tab 1 Primer sequences of MSX1 gene used for PCR外顯子 引物(5’ - 3′) 擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度(bp) 退火溫度（℃1 aF: CTGGCCTCGCCTTATTAGCR: CTTCTGGCAGCTTGAGGAGT661 581 bF: AGTGTCCCCTTCGCTCCTR: CTTCTGGCAGCTTGAGGAGT227 582F: ACTTGGCGGCACTCAATATCR: TGTGAGGGTTAAAGGGAAGG669 58

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本文編號(hào)：2831124