目的:探索不同濃度的星孢菌素對(duì)山羊顳下頜關(guān)節(jié)盤細(xì)胞自組裝基體兩周內(nèi)的收縮性及細(xì)胞外基質(zhì)合成的影響。方法:1.體外分離山羊顳下頜關(guān)節(jié)盤,Ⅰ型膠原酶過(guò)夜消化,提取關(guān)節(jié)盤細(xì)胞;單層培養(yǎng)山羊顳下頜關(guān)節(jié)盤細(xì)胞。甲苯胺藍(lán)染色和Ⅰ型膠原免疫組織化學(xué)染色鑒定P3代細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix,ECM)的分布。2.利用24孔板制作直徑為5mm,深度為10mm的圓柱形瓊脂糖模具;每個(gè)瓊脂糖井用完全培養(yǎng)基連續(xù)換液一周。3.收集P3代關(guān)節(jié)盤細(xì)胞,以5.5×10~6個(gè)細(xì)胞按照對(duì)照組和不同濃度的星孢菌素(Staurosporine)組(0.1nM,1nM,10nM,100nM)種入每個(gè)瓊脂糖井,每天每井相應(yīng)換液,培養(yǎng)至一周和兩周。4.觀察自組裝基體的形態(tài)變化;冰凍切片做天狼猩紅染色展示膠原分布,番紅染色顯示糖胺聚糖(Glycosaminoglycan,GAGs)的分布;免疫組織化學(xué)染色顯示Ⅰ型膠原、及α-肌動(dòng)蛋白(α-Smooth muscle actin,α-SMA)的分布;ELISA和Blyscan試劑盒檢測(cè)不同時(shí)間段細(xì)胞外基質(zhì)含量的變化。結(jié)果:1.光學(xué)顯微鏡下P0,P1,P2及P3代的不同代次細(xì)胞形態(tài):從P0代到P3代,細(xì)胞形態(tài)逐漸變?yōu)楸馄降拈L(zhǎng)梭形和多邊形,其中P3代細(xì)胞形態(tài)明顯粗大。P3代細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色和Ⅰ型膠原免疫組織化學(xué)染色為陽(yáng)性,顯示細(xì)胞外基質(zhì)糖胺聚糖(GAGs)和Ⅰ型膠原的合成。2.星孢菌素組和對(duì)照組細(xì)胞均在瓊脂糖井內(nèi)自組裝成球形,一周內(nèi)各組基體都有收縮現(xiàn)象,兩周內(nèi)基體形態(tài)變化基本穩(wěn)定;其中,10nM星孢菌素組直徑和濕重最大(P0.01);兩周時(shí)各組基體濕重有增加,但直徑增加不是很明顯(P0.01)。3.一周和兩周冰凍切片染色顯示:各組基體天狼猩紅,番紅及Ⅰ型膠原免疫組織化學(xué)染色為陽(yáng)性,星孢菌素組更明顯,尤其10nM組為強(qiáng)陽(yáng)性;而星孢菌素組相對(duì)于對(duì)照組α-SMA免疫組織化學(xué)染色為弱陽(yáng)性。4.ELISA檢測(cè)的自組裝基體內(nèi)的Ⅰ型膠原含量和Blyscan試劑盒檢測(cè)的GAGs含量顯示星孢菌素組高于對(duì)照組,其中10nM組最明顯(P㩳0.01);另外,各組基體在兩周時(shí)細(xì)胞外基質(zhì)的含量高于一周組(P0.01)。結(jié)論:不同濃度星孢菌素對(duì)于預(yù)防自組裝基體的收縮有一定效果,但不是非常突出,它更有利于自組裝基體細(xì)胞外基質(zhì)的合成。
【學(xué)位單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R782.6
【部分圖文】：

培養(yǎng)及自組裝模具下獲取山羊顳下頜關(guān)節(jié)盤組織（圖 1），Ⅰ型膠原酶）（圖 1），原代山羊顳下頜關(guān)節(jié)盤細(xì)胞在一周左右 80%-90%；之后，細(xì)胞的生長(zhǎng)速度是加快的，約四到 P0，P1，P2 及 P3 代的不同代次細(xì)胞（圖 2）形態(tài)P3 代明顯為粗大，扁平的長(zhǎng)梭形和多邊形，且數(shù)量染色（GAGs）及免疫組化染色（Ⅰ型膠原）均為節(jié)盤細(xì)胞胞外基質(zhì)。粘接鋼柱后，制作瓊脂糖井，并且完全培養(yǎng)基換液

a. a. 山羊顳下頜關(guān)節(jié)盤細(xì)胞 P0 代；b. P1 代；c. P2 代；d. P3 代；e. P3 代甲苯胺藍(lán)染色；f. P3 代Ⅰ型膠原免疫組織化學(xué)染色圖 2 山羊顳下頜關(guān)節(jié)盤細(xì)胞 100a. 粘接鋼珠柱；b. 24h 瓊脂糖井；c. 一周瓊脂糖井圖 3 自組裝模具制作

20a. 粘接鋼珠柱；b. 24h 瓊脂糖井；c. 一周瓊脂糖井圖 3 自組裝模具制作6.2 自組裝基體形態(tài)觀察山羊顳下頜關(guān)節(jié)盤細(xì)胞接種到瓊脂糖井內(nèi)后，4h 后可見(jiàn)對(duì)照組和星孢菌素組的細(xì)胞在井底瓊脂糖表面形成圓盤狀結(jié)構(gòu)(圖 4)，乳白色，直徑約（5.0±0.3）mm，24h-96h 中形態(tài)（圖 5）為成圓球狀，并且直徑逐漸縮小，一周時(shí)對(duì)照組和星孢菌素組直徑有差異（圖 6）；星孢菌素組自組裝基體的直徑、濕重（表 1）比對(duì)照組大（P㩳0.01）。星孢菌素組較對(duì)照組收縮小，并且 10nM 組形態(tài)為凹

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9 毛凱平;鄒t

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