發(fā)布時間：2020-09-22 19:39

　　 研究背景： 隨著生活水平的提高,人工種植體的應(yīng)用日趨廣泛,人們對生物材料的安全性及生物活性有更高的要求。金屬純鈦強(qiáng)度大,有良好的耐熱性、耐低溫性,彈性模量低,無磁性,無毒,生物相容性好,其合金有好的耐熱強(qiáng)度、低溫韌性和斷裂韌性,因此,鈦被廣泛地應(yīng)用于硬組織的修復(fù)和替換材料,成為首選的金屬醫(yī)用材料。但是鈦自身缺乏骨誘導(dǎo)性能,與周圍組織無強(qiáng)有力的機(jī)械結(jié)合,生物活性差,在機(jī)體環(huán)境下可被腐蝕,釋放金屬離子,這些都影響著鈦種植體的穩(wěn)定和長期成功率。隨著近年來材料學(xué)的發(fā)展,鈦表面處理技術(shù)一直是研究的熱點和重點,如何通過材料表面處理獲得更好的骨結(jié)合能力,縮短骨愈合時間成為眾多學(xué)者的研究目標(biāo)并獲得了良好的效果。鈦表面改性后,多數(shù)形成微粗糙或粗糙表面,這雖然有利于骨整合但是同時也更利于細(xì)菌的附著,而金屬鈦本身并不具備抗菌功能,因此在對鈦表面進(jìn)行生物活性改性的同時,對其進(jìn)行抗菌改性有著重要意義。 目前鈦表面改性的方法主要有,等離子噴涂(plasma sprayed coating, PSC)、離子束輔助沉積(ion beam assisted deposition, IBAD)、脈沖激光沉積(pulsedlaser deposition, PLD)、仿生溶液生長法(biomimetic deposition)、溶膠-凝膠法(sol-gel processing)、堿熱處理法(alkaline and heating treatment)、噴砂和酸蝕處理(sandblasted and acid-etching, SLA)、可吸收性研磨介質(zhì)處理(resorbable blast media, RBM)、離子注入法(Ion implantation method)、激光轟擊法(Laser ablation)以及微弧氧化(micro-arc oxidation, MAO)法等。微弧氧化法可在鈦金屬表面原位生成以鈦金屬為基體的陶瓷膜層,該膜層加強(qiáng)了鈦表面的抗腐蝕性能,跟其他方法相比,微弧氧化法生成的膜層與基體的結(jié)合力更強(qiáng),硬度更高。通過控制電解液的組分和濃度,還可在鈦表面生成適當(dāng)鈣磷比的膜層。有研究報道通過該方法能在鈦表面生成具有骨誘導(dǎo)性能的羥基磷灰石和具良好生物活性的金紅石和銳鈦礦型TiO2,從而促進(jìn)骨結(jié)合,加快骨愈合。 目前的抗菌材料中,銀因具有殺菌廣譜性,殺菌功能強(qiáng)大,不產(chǎn)生耐藥性,對機(jī)體無毒性,殺菌作用持久等優(yōu)點成為目前前景最廣闊的抗菌材料。 本實驗通過在傳統(tǒng)的含鈣、磷鹽的微弧氧化電解液中添加硝酸銀成分,調(diào)控電解液中各組分的比例,制備含鈣、磷、銀的復(fù)合陶瓷膜層。該膜層在促進(jìn)成骨細(xì)胞的粘附、增殖、分化,提高成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性的同時,還對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及牙齦卟啉單胞菌具備抗菌能力,這是傳統(tǒng)微弧氧化膜層不具備的性能。 目的： 本課題通過研究鈦表面含鈣、磷、銀復(fù)合陶瓷膜層的微弧氧化制備方法并進(jìn)一步研究該膜層的表面特性、細(xì)胞生物活性及其抗菌性能,為在鈦表面制備既具良好生物活性又具抗菌性能的復(fù)合膜層的研究提供理論依據(jù)。 材料和方法： 1.實驗分三組,空白對照組為M組是機(jī)械打磨的鈦樣品,實驗對照組為MAO組是傳統(tǒng)鈣、磷鹽電解液配方制備的鈦樣品,實驗組為MAO-Ag組是電解液中含鈣鹽、磷鹽、硝酸銀配方制備的鈦樣品。細(xì)胞實驗使用規(guī)格為Φ15mmm,厚度1mm的圓形鈦片；抗菌實驗使用規(guī)格為23mm×23mm的正方形鈦片,厚度為1mm。各組鈦片制備好后常溫下自然干燥,進(jìn)行理化性能的檢測,包括掃描電子顯微鏡(SEM)觀察表面形貌,表面輪廓儀測量其粗糙度,表面接觸角測試儀測量靜態(tài)水接觸角,X射線能量色散譜儀(EDS)對其進(jìn)行表面元素成分及含量分析,X射線衍射儀(XRD)對其表面元素的存在形式進(jìn)行分析。 2.人成骨肉瘤細(xì)胞系MG63細(xì)胞及ATCC成纖維細(xì)胞分別接種于三組鈦片的48h浸泡液中培養(yǎng),24h后光鏡觀察細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行細(xì)胞毒性定性檢測,MTS法進(jìn)行定量檢測細(xì)胞毒性 3.人成骨肉瘤細(xì)胞系MG63接種于三組鈦片表面,2h、4h、8h、24h后,將鈦片進(jìn)行掃描電鏡前樣品處理,于掃描電鏡下觀察細(xì)胞的粘附,伸展及分化的形態(tài)變化。用Hoechst33342染色劑對接種鈦片上2h、4h、8h的細(xì)胞進(jìn)行核染色,在熒光顯微鏡下拍攝圖片,用IPP圖像處理軟件進(jìn)行計數(shù),計算其粘附率,比較各組鈦片表面細(xì)胞的粘附水平。 4.對接種于各組鈦片上的人成骨肉瘤細(xì)胞系MG63細(xì)胞進(jìn)行MTS法增殖檢測及堿性磷酸酶(ALP)的檢測。MTS檢測增殖設(shè)置的時間點為細(xì)胞接種1d、3d、5d、7d,ALP檢測設(shè)置的時間點為細(xì)胞接種后7d、14d、21d。 5.抗菌實驗采用貼膜法,按照GB/T21510-2008國家標(biāo)準(zhǔn),定量檢測各組鈦片對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、牙齦卟啉單胞菌的抗菌性能。 6.以上細(xì)胞實驗每個時間段每個處理組均設(shè)6個樣本,每個樣本重復(fù)3次測量。貼膜法抗菌實驗按照國家標(biāo)準(zhǔn)每組設(shè)3個樣本,洗脫液梯度稀釋,每個梯度設(shè)置2個平行樣本,實驗重復(fù)3次,結(jié)果取平均值。所得數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示,采用SPSS13.0數(shù)據(jù)處理軟件分析,析因分析分析時間與處理因素之間的交互效應(yīng)；多個樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析(one-Way ANOVA), Levene's test檢驗方差齊性,方差齊則采用LSD樣本均數(shù)間的兩兩比較,方差不齊則采用近似F檢驗的Welch方法進(jìn)行方差分析,Dunnett's T3多重比較。假設(shè)檢驗為雙側(cè)檢驗,檢驗標(biāo)準(zhǔn)0.05,P0.05時差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 實驗結(jié)果： 1.經(jīng)掃描電鏡觀察M組鈦片呈方向一致的溝槽狀劃痕；MAO組及MAO-Ag組呈現(xiàn)均勻分布的大小不一的火山丘狀微孔,孔隙大小約1-5μm；MAO-Ag組和MAO組之間形貌并無差別。經(jīng)微弧氧化處理后,鈦片表面粗糙度值Ra增高,但MAO-Ag組和MAO組之間并無差異,Ra值結(jié)果為MAO-Ag組=MAO組M組。表面接觸角測量結(jié)果為MAO-Ag組=MAO組M組。EDS結(jié)果顯示,M組表面只存在Ti元素,MAO組表面含Ti、Ca、P、O四種元素,MAO-Ag組表面含Ti、Ca、P、O、Ag五種元素。XRD分析表面元素存在形式,發(fā)現(xiàn)MAO-Ag組和MAO組表面均生成銳鈦礦和金紅石型Ti02,且MAO-Ag組出現(xiàn)銀元素的衍射峰。理化性能檢測表明,微弧氧化處理改變了純鈦表面形貌、粗糙度、接觸角以及表面化學(xué)成分；通過微弧氧化可在鈦表面生成生物活性良好的金紅石和銳鈦礦型Ti02,且將鈣、磷、銀元素載入鈦表面氧化膜層；電解液中添加硝酸銀成分并未造成兩組微弧氧化膜層的物理性能差異,只在元素種類及含量上有差異。 2.細(xì)胞毒性檢測結(jié)果示三組鈦片48h浸泡液培養(yǎng)的ATCC成纖維細(xì)胞及MG63細(xì)胞形態(tài)正常,生長良好,而含苯酚的陽性對照組中的細(xì)胞則出現(xiàn)細(xì)胞圓縮死亡,細(xì)胞內(nèi)泡性變；MTS定量檢測細(xì)胞毒性結(jié)果示三組鈦片的細(xì)胞毒性均為0級,含苯酚的陽性對照組細(xì)胞毒性為3級毒性,說明在鈦表面載入微量的銀對細(xì)胞無毒性。 3.SEM觀察示接種于MAO-Ag組和MAO組表面的MG63細(xì)胞粘附、伸展及分化水平在2h、4h、8h、24h四個時間段均優(yōu)于M組表面的MG63細(xì)胞；在同一時間點上,MAO-Ag組和MAO組表面粘附更多細(xì)胞,且細(xì)胞的伸展范圍較M組大；24h時MAO-Ag組和MAO組表面可見比M組更多的新增殖細(xì)胞及分裂中細(xì)胞。粘附率檢測結(jié)果示2h、4h時,MAO-Ag組和MAO組表面細(xì)胞粘附率高于M組,8h時三組之間無明顯差異。三組鈦片表面細(xì)胞粘附率呈時間依賴性逐漸上升,MAO-Ag組和MAO組鈦片促進(jìn)MG63細(xì)胞的早期粘附。 4.MTS增殖檢測結(jié)果示1d、3d、5d、7d四個時間點的OD值均呈現(xiàn)MAO-Ag組=MAO組M組,且在設(shè)置的時間點內(nèi)隨著時間的推移,各組的OD值增大,說明MAO-Ag組和MAO組鈦片均能促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖。ALP檢測結(jié)果示7d、14d、21d三個時間點的OD值均呈現(xiàn)MAO-Ag組=MAO組M組,且各組的OD值在14d最高。微弧氧化改性后的MAO-Ag組和MAO組鈦片表現(xiàn)比未經(jīng)表面處理的M組更優(yōu)異的生物活性。 5.貼膜法抗菌實驗結(jié)果顯示接種24h后,平板計數(shù)顯示M組及MAO組鈦片表面三種細(xì)菌均出現(xiàn)繁殖,而MAO-Ag組的鈦片則對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、牙齦卟啉單胞菌抗菌率均達(dá)99.9%。MAO-Ag組對牙齦卟啉單胞菌表現(xiàn)了良好的抗菌性能。 結(jié)論： 1.通過微弧氧化法可以在純鈦表面制備載鈣、磷、銀復(fù)合陶瓷膜層。且該膜層的表面形貌及物理性能與含鈣、磷電解液中制備的微弧氧化膜層一致,均增高了鈦表面粗糙度及親水性,表面均生成銳鈦礦和金紅石型的Ti02。 2.微弧氧化法制備的載鈣、磷、銀復(fù)合陶瓷膜層具備良好的生物安全性,對人成骨肉瘤細(xì)胞系MG63細(xì)胞及ATCC成纖維細(xì)胞無細(xì)胞毒性。能促進(jìn)MG63細(xì)胞在其表面粘附、伸展、分化；促進(jìn)MG63細(xì)胞的早期粘附,細(xì)胞的粘附率呈時間依賴性,隨著時間的推移而增大；能在1d、3d、5d、7d內(nèi)促進(jìn)MG63細(xì)胞增殖,在測試的時間內(nèi)其表面細(xì)胞增殖活性隨時間的增加而增高；在MAO-Ag組表現(xiàn)出比M組更高的ALP活性,在測試時間內(nèi)ALP活性在14d達(dá)到高峰,該膜層能促進(jìn)成骨細(xì)胞ALP合成。 3.本實驗制備的載鈣、磷、銀微弧氧化陶瓷膜層在表現(xiàn)優(yōu)異的生物學(xué)活性的同時具備良好的抗菌功能,對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、牙齦卟啉單胞菌均有良好的抗菌功能,這是載鈣、磷微弧氧陶瓷膜層不具備的功能。
【學(xué)位單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2012
【中圖分類】：R783

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2824833