口腔黏膜鱗癌(oralsquamouscellcarcinoma,OSCC，簡(jiǎn)稱口腔癌)是口腔頜面部最常見的惡性腫瘤，局部復(fù)發(fā)和頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是其致死的主要原因。近年來，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymaltransition,EMT)在惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中可能發(fā)揮關(guān)鍵作用受到廣泛關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)Snail通過抑制E-cadherin表達(dá)在EMT過程中起核心調(diào)控作用，是其關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。 目的：本研究通過構(gòu)建pEGFP-N1-Snail真核表達(dá)質(zhì)粒，檢測(cè)過表達(dá)Snail的口腔癌細(xì)胞SCC9的生物學(xué)特性變化，探討Snail在口腔癌細(xì)胞EMT及侵襲轉(zhuǎn)移過程中的作用；在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步驗(yàn)證過表達(dá)Snail的口腔癌細(xì)胞是否獲得腫瘤干細(xì)胞(cancerstemcell,CSC)樣特性。 方法：成功構(gòu)建pEGFP-N1-Snail真核表達(dá)質(zhì)粒。分別抽提pEGFP-N1及pEGFP-N1-Snail質(zhì)粒，用脂質(zhì)體2000(Lipofectamine2000)轉(zhuǎn)染SCC9腫瘤上皮細(xì)胞，通過G418篩選，獲得穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株SCC9-N（對(duì)照組）及SCC9-S（實(shí)驗(yàn)組）。通過實(shí)時(shí)定量(QuantitativeReal-TimePCR,qPCR)，免疫蛋白印跡技術(shù)(WesternBlotting)，免疫熒光顯微方法(ImmunofluorescenceMicroscopy)檢測(cè)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中E-鈣粘蛋白(E-cadherin)，-連環(huán)蛋白(-catenin)，Snail，波形蛋白(vimentin)相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)水平。應(yīng)用劃痕實(shí)驗(yàn)(Wound-HealingAssay)，侵襲實(shí)驗(yàn)(InvasionAssay)，粘附實(shí)驗(yàn)(AdhesionAssay)檢測(cè)細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力。另外，通過細(xì)胞流式技術(shù)(FlowCytometry)及單克隆形成實(shí)驗(yàn)(Colony-FormingAssay)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的腫瘤細(xì)胞獲得了干細(xì)胞樣特點(diǎn)。 結(jié)果：成功構(gòu)建了pEGFP-N1-Snail真核表達(dá)質(zhì)粒，將pEGFP-N1及pEGFP-N1-Snail分別轉(zhuǎn)染SCC9腫瘤上皮細(xì)胞,獲得穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株SCC9-N（對(duì)照組）及SCC9-S（實(shí)驗(yàn)組）。過表達(dá)Snail誘導(dǎo)SCC9細(xì)胞發(fā)生了EMT，細(xì)胞形態(tài)從上皮樣向成纖維樣改變，典型的鋪路石狀向長梭形轉(zhuǎn)變，細(xì)胞間變得松散，粘附能力減弱。上皮標(biāo)記物E-cadherin和-catenin表達(dá)下降，而間質(zhì)標(biāo)記物vimentin表達(dá)上升，細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。更重要的是，Snail不僅誘導(dǎo)SCC9細(xì)胞發(fā)生了EMT，同時(shí)使這些間質(zhì)細(xì)胞具有了CSC樣特點(diǎn)，雖然細(xì)胞的侵襲能力增強(qiáng)，但是增殖能力卻是減弱了，細(xì)胞不能向劃痕處遷移，處于S期的細(xì)胞比例減少，形成的克隆較對(duì)照組減少，但SCC9-S細(xì)胞仍具有自我更新能力，能形成新的克隆，同時(shí)表達(dá)相關(guān)CSC標(biāo)記物，CD24在SCC9-S細(xì)胞中表達(dá)明顯下降，CD44在兩組細(xì)胞中均為高表達(dá)，而CD133在兩組細(xì)胞中均不表達(dá)，SCC9-S細(xì)胞為CD133-, CD44high/CD24low， SCC9-N細(xì)胞為CD133-,CD44high/CD24+。 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了pEGFP-N1-Snail真核表達(dá)質(zhì)粒，并獲得了增強(qiáng)表達(dá)Snail的穩(wěn)定細(xì)胞株，Snail作為轉(zhuǎn)錄抑制因子能誘導(dǎo)SCC9細(xì)胞發(fā)生EMT，并使間質(zhì)細(xì)胞具有了CSC樣特點(diǎn)。進(jìn)一步證實(shí)了Snail在口腔癌侵襲轉(zhuǎn)移過程中的重要作用。
【學(xué)位單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2012
【中圖分類】：R739.8

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本文編號(hào)：2823447