本文檢測(cè)和分選人舌鱗癌細(xì)胞株Tca8113中的側(cè)群細(xì)胞(side population cells ,SP cells),并對(duì)其體外增殖、致瘤能力進(jìn)行初步分析。以考察人舌鱗癌細(xì)胞株Tca8113中的側(cè)群細(xì)胞是否具有類腫瘤干細(xì)胞的生物學(xué)特性,為舌鱗癌中腫瘤干細(xì)胞的有效富集策略提供新的方案。 1. Tca88813細(xì)胞株Hoechest33342染色及流式細(xì)胞技術(shù)SP細(xì)胞分選 方法:將人舌鱗癌細(xì)胞株Tca8113培養(yǎng)在含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基完全培養(yǎng)液中,置于5%CO2,3 7℃飽和溫度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每日換液當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到鋪滿瓶底80%時(shí)加完全培養(yǎng)液按1:2或1:3傳代培養(yǎng)。取數(shù)瓶已培養(yǎng)的細(xì)胞,細(xì)胞總量為108數(shù)量級(jí)。①以0.01%P B S沖洗,適量0.125%胰酶消化,中止消化后,HBSS(8g/L Nacl, 0.4g/L Kcl, 1g/L葡萄糖, 60mg/L KH2PO4, 47.5 mg/L Na2HPO4,調(diào)pH至7.2.)洗滌,重懸,離心,棄上清。②Hoechest33342染色,將1ml/ml的Hoechest33342及維拉帕米加入單細(xì)胞懸液中,使其Hoechest33342終濃度為5μg/ml。3 7℃恒溫水浴90分鐘,并時(shí)常晃動(dòng)充分混勻;③90分鐘后, 4℃低溫離心500r/min,10min;收集沉淀,在4℃用含2 /ml碘化丙啶(PI)的HBSS平衡鹽溶液平衡沉淀即為染色好的細(xì)胞(PI目的為標(biāo)記死細(xì)胞);④流式細(xì)胞儀檢測(cè)分選,激發(fā)光波長(zhǎng)為350nm,采集波長(zhǎng)為450nm和675nm(分選前標(biāo)本保持在4℃),上機(jī)分選,發(fā)光偏弱的就是SP細(xì)胞。結(jié)果:Hoechest33342染色后,對(duì)照組加入維拉帕米拮抗,通過流式細(xì)胞儀分選到Tca8113中的SP細(xì)胞約占總細(xì)胞數(shù)量0.8%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,人舌鱗癌細(xì)胞株Tca8113中含有微量的SP細(xì)胞。 2.甲基偶氮唑藍(lán)( MTT)法檢測(cè)SP細(xì)胞體外增殖能力 方法:將分選的SP細(xì)胞,MP細(xì)胞以及未分選的細(xì)胞種植于9 6孔板內(nèi),每孔加用0.2ml含20ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、20ng /ml表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、5μg/ml胰島素的的無血清培養(yǎng)液,2000細(xì)胞/孔(設(shè)空白組用于調(diào)零)。置于5%CO2,37℃飽和溫度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每2 d換液1次,在第1、3、5、7d用MTT比色法測(cè)定細(xì)胞的增殖狀態(tài),以490nm吸光度(A)值量化活細(xì)胞數(shù),每組所得數(shù)據(jù)取均值,繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,比較3組細(xì)胞的增殖速度。結(jié)果:分選出的SP細(xì)胞,立即在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng),細(xì)胞呈單細(xì)胞、球形、懸浮生長(zhǎng)。隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),細(xì)胞呈團(tuán)塊狀生長(zhǎng)體積逐漸增大,細(xì)胞數(shù)量增多,培養(yǎng)5d后,細(xì)胞呈葡萄串狀生長(zhǎng),腫瘤球形成。將懸浮細(xì)胞離心,用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng),24h后細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。而根據(jù)MTT比色法于測(cè)定吸光度(A)值顯示,在無血清培養(yǎng)基中,SP細(xì)胞與MP細(xì)胞以及未分選細(xì)胞相比,有較強(qiáng)的體外擴(kuò)增能力,且1-3d及5-7d時(shí)更為顯著。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了Tca88813細(xì)胞株中的SP細(xì)胞具有類腫瘤干細(xì)胞的體外擴(kuò)增能力。 3.SP細(xì)胞及未分選細(xì)胞裸鼠皮下接種動(dòng)物模型建立 方法:選取24只8周齡雌性NOD/SCID小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,隨機(jī)分為兩組組(即SP及未分選組)每組12只,各組內(nèi)隨機(jī)分成A、B、C、D4個(gè)小組,分別給予背部皮下細(xì)胞接種,數(shù)量級(jí)分別為103 104 105 106/ml,注射后于無菌飼養(yǎng)間內(nèi)飼養(yǎng),觀察裸鼠成瘤情況。結(jié)果:103數(shù)量級(jí)的SP及未分選細(xì)胞接種的裸鼠,均未成瘤。接種13d后, 105、106數(shù)量級(jí)的SP接種裸鼠背部出現(xiàn)瘤體,14d后104數(shù)量級(jí)SP細(xì)胞及106數(shù)量級(jí)未分選細(xì)胞接種的裸鼠背部出現(xiàn)瘤體。28d后,瘤體直徑均達(dá)到1-1.3cm。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,Tca88813細(xì)胞株中的SP細(xì)胞具有類腫瘤干細(xì)胞的高成瘤能力。 研究結(jié)果表明,舌癌中的SP細(xì)胞可作為舌癌干細(xì)胞富集策略之一。人舌鱗癌中存在類腫瘤干細(xì)胞,并具有自我更新及高致瘤性。
【學(xué)位單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2009
【中圖分類】：R739.86
【部分圖文】：

附 圖Hoechest33342染色組↓（H） 對(duì)照組維拉帕米拮抗組↓（H+V）圖1 流式細(xì)胞儀分選結(jié)果Fig.1 Results of flow cytometry isolation

圖2 SP細(xì)胞體外無血清培養(yǎng)Fig.2 Culture the SP cells in serum-free mediumRPMI1640 culture solution1.細(xì)胞分選后1天，單個(gè)細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)；2.細(xì)胞分選后2天，細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，呈團(tuán)塊狀生長(zhǎng)；3.分選后4天，細(xì)胞數(shù)量繼續(xù)增多，呈葡萄串狀生長(zhǎng)；4.分選后5天，細(xì)胞數(shù)量增加體積增大，腫瘤球形成；5. 將懸浮細(xì)胞離心，用含10％小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)，24h后細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。

A BC D圖3 各組裸鼠成瘤情況Fig.3 Tumorigenicity of mice in defrent groupsafter hypodermic inoculationA．103數(shù)量級(jí)的SP及未分選細(xì)胞接種裸鼠；B．104、 105數(shù)量級(jí)的SP接種裸鼠；C．106數(shù)量級(jí)SP細(xì)胞及未分選細(xì)胞接種的裸鼠；D．大體觀瘤體呈灰白色，表面呈結(jié)節(jié)狀。

【參考文獻(xiàn)】

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1 王開;康非吾;閔睿;王佐林;朱炎;;Tca-8113細(xì)胞系單細(xì)胞體外增殖的實(shí)驗(yàn)觀察[J];口腔頜面外科雜志;2008年06期

2 溫玉明;劉坤;華成舸;潘劍;李龍江;陳紹維;王昌美;高慶紅;;腺樣囊性癌細(xì)胞系中腫瘤干細(xì)胞的生物學(xué)特性初探[J];中國(guó)口腔頜面外科雜志;2006年04期

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