目的： 1.直接檢測(cè)竹紅菌乙素HB溶在DMSO溶液中并稀釋在RPMI-1640培養(yǎng)液中的吸收波長(zhǎng)，選擇適合本實(shí)驗(yàn)的波長(zhǎng)的激光儀。 2.初步探討在PDT作用下竹紅菌乙素HB對(duì)人舌鱗癌Tca8113細(xì)胞的殺傷抑制作用,并通過一定實(shí)驗(yàn)方法了解細(xì)胞死亡機(jī)制。 方法： 第一部分藥品處理：將進(jìn)口成品HB粉末10mg全部取出，先用10mlDMSO溶劑將其全部充分溶解，配制成濃度為1mg/ml棕黃色的A液。然后吸取適量A液在100ML含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液中混勻，將其稀釋成HB終濃度為0.5μM的測(cè)試液，測(cè)試在室溫下進(jìn)行。用BECKMAN DU series600紫外可見分光光度計(jì)對(duì)測(cè)試液進(jìn)行掃描，范圍為400nm至700nm，掃描后可得出HB的吸光度值A(chǔ)值及吸收波長(zhǎng)曲線圖。以最大A值對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)值定為最適實(shí)驗(yàn)波長(zhǎng)。第二部分1.細(xì)胞培養(yǎng)：Tca8113細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)基為10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，置于孵箱（5%CO2、37.0℃恒溫）中孵育，培養(yǎng)3-4天后傳代或凍存。2.實(shí)驗(yàn)時(shí)一般選對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，常規(guī)消化后均勻吹打，使其成為單細(xì)胞懸液，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/ml，按實(shí)驗(yàn)要求接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔200μl，即每孔細(xì)胞量約為2×10~5個(gè)，培養(yǎng)板繼續(xù)放入孵箱內(nèi)孵育24h（隔夜）,第二日細(xì)胞完全貼壁后吸出上清液。各孔中分別加入含不同預(yù)設(shè)濃度HB的RPMI-1640培養(yǎng)液（不含胎牛血清）又繼續(xù)孵育4h,然后在不同預(yù)設(shè)激光能量密度的激光（波長(zhǎng)為470nm）下垂直照射后，再孵育24h，最后用MTT法（λ=490nm）檢測(cè)各孔的OD值，測(cè)試重復(fù)3次，根據(jù)均值代入公式計(jì)算細(xì)胞殺傷抑制率。3、選取實(shí)驗(yàn)細(xì)胞同2，選用12孔培養(yǎng)板，每孔接種量為1ml。然后經(jīng)同樣的孵育及PDT光照處理后，用于光學(xué)倒置顯微鏡下觀察，同時(shí)用Hochst33258染色法在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化；另外，用Annexin-V-FITC/PI雙染法對(duì)各組細(xì)胞處理后上流式細(xì)胞儀定量檢測(cè)分析細(xì)胞凋亡率（1h內(nèi)）。 結(jié)果： 第一部分HB的RPMI-1640培養(yǎng)液測(cè)試液出現(xiàn)3個(gè)吸收峰，峰值位于475nm、545nm、585nm，且可見對(duì)應(yīng)475nm處的峰值明顯高于其他2處。第二部分1.對(duì)照組單加HB藥物組與單純PDT組對(duì)細(xì)胞均無明顯殺傷抑制作用。2.HB-PDT細(xì)胞組在不同劑量的激光能量密度下對(duì)細(xì)胞均有不同的殺傷抑制作用，且在一定范圍內(nèi)，隨著藥物濃度和光照強(qiáng)度增加，其殺傷作用也顯著增強(qiáng)，呈正相關(guān)關(guān)系。3.HB濃度和PDT強(qiáng)度為中度時(shí)，PDT處理6h后其細(xì)胞死亡機(jī)制多以凋亡為主。 結(jié)論： 1. HB的DMSO溶液在RPMI-1640培養(yǎng)液中在475nm處出現(xiàn)最大吸收峰值，說明波長(zhǎng)為接近475nm的激光能使竹紅菌素發(fā)揮最大的光動(dòng)力效應(yīng)，因此本實(shí)驗(yàn)選用固定輸出波長(zhǎng)為470nm的激光儀進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 2. HB在PDT作用下對(duì)體外人舌鱗癌Tca8113細(xì)胞有明顯的抑制作用，且在一定范圍內(nèi)與HB濃度和PDT強(qiáng)度呈正相關(guān)關(guān)系。 3．HB本身對(duì)Tca8113細(xì)胞的抑制效果不強(qiáng)，但聯(lián)合PDT作用后則顯著增強(qiáng)，說明竹紅菌乙素HB具有顯著地光動(dòng)力性質(zhì)；這種抑制作用機(jī)制主要是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的。另外，PDT作用后6h即能檢測(cè)出較高的細(xì)胞凋亡率，說明竹紅菌素HB具有較高的光動(dòng)力作用效率。
【學(xué)位單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2012
【中圖分類】：R739.86
【部分圖文】：

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驗(yàn)組 2 細(xì)胞光學(xué)倒置顯微鏡下生長(zhǎng)情況tion of experiment2 Tca8113 cell under inv白對(duì)照組 Tca8113 細(xì)胞熒光顯微鏡下染色 control Tca8113 cell under fluorescence m

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【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2823377