研究背景與目的:牙周病治療的最終目標(biāo)是使因炎癥破壞的牙周組織得到再生和重建,基于干細(xì)胞、支架材料、生長(zhǎng)因子的組織工程技術(shù)為牙周組織再生提供了有效的思路和方法。雖然間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)移植治療在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域取得了一定的效果,但仍存在所需細(xì)胞量大、生存率低、致瘤和致畸等安全性問(wèn)題,因此亟需新的方法以促進(jìn)組織再生。越來(lái)越多的研究表明,干細(xì)胞的旁分泌功能,即干細(xì)胞移植后分泌的生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子是干細(xì)胞促進(jìn)組織再生的主要機(jī)制。相比于干細(xì)胞移植,間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)液(Conditioned medium from MSCs,MSCs-CM)使用更加方便安全,具有更好的臨床轉(zhuǎn)化前景。牙周膜干細(xì)胞(Periodontal ligament stem cells,PDLSCs)是來(lái)源于牙周膜的一種成體干細(xì)胞,被認(rèn)為是牙周再生治療中較理想的種子細(xì)胞。研究表明應(yīng)用PDLSCs移植或者PDLSCs-CM均獲得了一定程度的牙周組織再生。然而,體外獲取PDLSCs需要有多個(gè)拔除牙齒的牙周膜,培養(yǎng)成功率較低,分離獲得周期較長(zhǎng)。因此,PDLSCs在牙周再生治療中的廣泛應(yīng)用受到了很大限制。牙齦干細(xì)胞(Gingiva-derived mesenchymal stem cells,GMSCs)是從牙齦中分離出來(lái)的間充質(zhì)干細(xì)胞,具有自我更新、多向分化潛能等間充質(zhì)干細(xì)胞的特性,用于牙周組織再生,亦取得了一定效果。相比于牙周膜干細(xì)胞,GMSCs取材方便,易于培養(yǎng),免疫調(diào)節(jié)功能更加優(yōu)越,因此GMSCs在牙周再生方面有更好的臨床應(yīng)用前景。目前還未見(jiàn)有牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)液用于牙周組織再生的研究。因此,本研究的目的是利用大鼠下頜第一磨牙牙周骨缺損模型,研究GMSCs-CM對(duì)牙周缺損再生的效果,并且與PDLSCs-CM進(jìn)行比較,為GMSCs-CM的應(yīng)用提供理論依據(jù)。研究方法:濃縮CM的制備:取臨床健康的人牙齦組織,組織塊法培養(yǎng)并傳代獲得人牙齦成纖維細(xì)胞(gingival fibroblasts,GFs),有限稀釋法克隆化分離培養(yǎng)獲得GMSCs,PDLSCs是張春澍同學(xué)慷慨相贈(zèng)。上述細(xì)胞在生長(zhǎng)培養(yǎng)基MEM中生長(zhǎng)至融合后,換用無(wú)血清MEM繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí),收集各組無(wú)細(xì)胞、無(wú)血清的條件培養(yǎng)液,超濾離心管濃縮100倍,BCA法測(cè)定各組蛋白質(zhì)濃度。大鼠牙周缺損模型的建立及分組處理:外科方法建立大鼠左側(cè)下頜第一磨牙頰側(cè)牙周骨缺損模型,Bio-gide膠原膜負(fù)載各組條件培養(yǎng)液,移植至牙周缺損,嚴(yán)密縫合。共分為五組:對(duì)照組,僅放置膠原膜;無(wú)血清培養(yǎng)基組(MEM組),膠原膜負(fù)載不含血清的濃縮α-MEM;GFs-CM組,膠原膜負(fù)載牙齦成纖維細(xì)胞濃縮條件培養(yǎng)液;GMSC-CM組:膠原膜負(fù)載牙齦干細(xì)胞濃縮條件培養(yǎng)液;PDLSCs-CM組:膠原膜負(fù)載牙周膜干細(xì)胞濃縮條件培養(yǎng)液。標(biāo)本處理及分析:分別于術(shù)后1周、2周、4周處死動(dòng)物,取左側(cè)下頜第一磨牙及牙周組織,脫鈣,石蠟包埋,進(jìn)行HE及Masson染色,組織學(xué)觀察并測(cè)量,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析各組牙周再生的情況。進(jìn)行腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)、白介素(interleukin,IL)-1β、-10 的免疫組化染色及分析,分析各組炎癥因子表達(dá)情況。對(duì)各組標(biāo)本進(jìn)行骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP)、Runt有關(guān)轉(zhuǎn)錄因子-2(Runt-related transcription factor 2,RUNX2),免疫組化染色,以分析成骨細(xì)胞分化情況。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類(lèi)】：R781.4
【部分圖文】：

消毒鋪巾。注射適量甲哌卡因局部浸潤(rùn)后，沿左側(cè)下頜骨下緣做一長(zhǎng)約逡逑１．５ｃｍ的口外切口，分離皮下筋膜，暴露咬肌，切斷咬肌筋膜，剝離骨膜，翻開(kāi)逡逑暴露骨面（圖１Ａ），避免損傷重要的血管、神經(jīng)。用渦輪機(jī)手機(jī)仔細(xì)地磨除下逡逑頜從第一磨牙近中至第二磨牙近中的頰側(cè)牙槽骨，冠方去除至牙槽嵴頂，根方到逡逑達(dá)根尖區(qū)，徹底刮除根面牙周膜、牙骨質(zhì)，建立一個(gè)長(zhǎng)、高３＿＊２＿牙周缺逡逑損，深約１ｍｍ邋（圖１Ｂ），手術(shù)過(guò)程中用大量生理鹽水沖洗術(shù)區(qū)。無(wú)菌棉球吸千，逡逑根據(jù)分組，分別將負(fù)載各組濃縮條件培養(yǎng)液，即ＭＥＭ，ＧＦｓ－ＣＭ，ＧＭＳＣｓ－ＣＭ，逡逑ＰＤＬＳＣｓ－ＣＭ，以及無(wú)菌生理鹽水的膠原膜植入缺損內(nèi)（圖１Ｃ）。咬肌復(fù)位，５－０逡逑縫線(xiàn)縫合肌層，復(fù)位皮膚采用３－０的縫線(xiàn)縫合，再次碘伏消毒傷口。術(shù)后密切觀逡逑１３逡逑

邐山東大學(xué)碩士學(xué)位論文邐逡逑結(jié)果逡逑１．１邐ＧＭＳＧｓ分離、培養(yǎng)及鑒定逡逑１．１．１邐ＧＭＳＣｓ的分離與培養(yǎng)逡逑組織塊培養(yǎng)７到１０天左右可觀察到組織塊周?chē)虚L(zhǎng)梭形細(xì)胞生長(zhǎng)，圍繞組逡逑織塊向周?chē)鷶U(kuò)展，增殖快速（圖２Ａ）。高倍鏡下，細(xì)胞呈成纖維細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞逡逑核居中（圖２Ｂ）。有限稀釋單個(gè)細(xì)胞約５天開(kāi)始形成包含多個(gè)細(xì)胞的集落，細(xì)胞逡逑形態(tài)相似，呈長(zhǎng)梭形，細(xì)胞增殖迅速，約２周時(shí)，集落中心細(xì)胞密集，呈菊花狀，逡逑向周?chē)派渑帕校▓D２Ｃ）。２周時(shí)結(jié)晶紫染色，可見(jiàn)培養(yǎng)皿底部多個(gè)淡藍(lán)色斑點(diǎn)逡逑（圖２Ｄ），邋ＧＭＳＣｓ的克隆形成率為２２％土２．９％。逡逑

逡逑１．邋１．２．邋２邋ＧＭＳＣｓ多向分化潛能檢測(cè)：經(jīng)成骨培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)２８天后，ＧＭＳＣｓ呈逡逑多層生長(zhǎng)，茜素紅染色可觀察到鈣結(jié)節(jié)（圖３Ｂ）。ＧＭＳＣｓ經(jīng)成脂培養(yǎng)基培養(yǎng)誘導(dǎo)逡逑１４天后，油紅染色可見(jiàn)紅色的脂肪微粒（圖３Ｃ），顯示ＧＭＳＣｓ具有向成脂肪細(xì)逡逑胞分化的能力。逡逑Ａ邋Ａ０１邋ｃｏｎｔｒｏｌ邐Ａ０２ＣＯ－３４邐Ａ０３邋ＣＯ－４５逡逑ｇ邋0ｍ邋Ｐｔ邋邐邋｜邋ＯＨ邋Ｐ１邐邋｜邋ＯＨ邋Ｐ１逡逑＾邋＾邋＾邋Ｊｉ邋＾邋＾邋Ｊｌ邐＾邋＾邋＾邋＾邋＾邋Ｊ＞邋＾逡逑ＰＥ邋Ａ邐ＰＣ邋Ａ邐Ｘ．Ａ逡逑Ａ０４ＣＯ－９０邐Ａ０６邋ＣＯ－４４邐Ａ0５邋ＣＤ－１０５逡逑｜邋０＾邋Ｐｔ邐邋｜邋０0？邋Ｐ１邐邋Ｉ邋Ｑ？ｔｅ邋Ｐｉ邐邐逡逑？邋Ｉ邋！邐？邋Ｉ逡逑ｊｙｉ逡逑Ｊ？Ｏｋｌ邋．ＵＫ邋．邋．Ｊ？Ｊｕ逡逑＾邋＾邋Ｊ邋＾邋＾邋＾邋＾邋Ｊ２邐＾邋＾邋Ｊ邋＾邋＾邋＾邋Ｊ＞邋Ｊｉ逡逑＿＿：}瑁咤危沐澹渝義賢跡沖澹牽停櫻茫蟾上赴約ㄥ義希粒毫魘較赴跫觳猓牽停櫻茫蟊礱姹曛疚锏謀澩錚唬攏哄澹牽停櫻茫蟪曬橋嘌觳舛嘞蚍皺義匣蹦�，硶袂颖K寂嘌玻柑歟嘌蟮撞啃緯傻能縊睪旖嶠阱�？￣４e埃埃�、硲亓x現(xiàn)盞跡洛澹牽停櫻茫缶芍盞寂嘌保刺

本文編號(hào)：2820349