目的： 口腔鱗癌(OSCC)是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一�？谇击[癌的治療,目前主要以外科手術(shù)為主,協(xié)同放化療或生物治療等的綜合治療,雖已取得了一定效果,但對于中晚期口腔鱗癌患者,療效仍不理想,總體生存率并無顯著提高。本文將研究轉(zhuǎn)錄因子FOXO3a在口腔鱗癌中的表達及其功能活性調(diào)控與PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導通路的相互關(guān)系,同時探討FOXO3a功能再活化對口腔鱗癌細胞在體內(nèi)外的抗癌作用。通過本研究,擬為靶向治療篩選口腔鱗癌癌變過程中的關(guān)鍵基因,為今后口腔鱗癌靶向治療研究打下一定的基礎(chǔ),以期為口腔鱗癌提供一種新的治療策略以補充甚至替代現(xiàn)有的治療手段。 方法： 1、應用Real-time PCR與免疫組織化學的方法分別在mRNA與蛋白水平檢測63例口腔鱗癌組織標本和癌旁正常組織中轉(zhuǎn)錄因子FOXO3a基因的表達,并通過統(tǒng)計處理,分析其基因表達與煙酒暴露、腫瘤部位、大小、TNM臨床分期、病理分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理的相關(guān)性；初步分析FOXO3a基因表達與PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導通路中的癌激酶AKT的活性蛋白p-AKT表達的相關(guān)性。 2、單純或聯(lián)合應用IGF-1與PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導通路抑制劑LY294002處理口腔鱗癌細胞,通過蛋白免疫印跡法檢測AKT的活性蛋白p-AKT表達水平,反映PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導通路的激活或抑制狀態(tài)；應用蛋白免疫印跡法檢測FOXO3a及p-FOXO3a蛋白在細胞總蛋白及胞漿胞核蛋白中的表達變化；應用Real-timePCR與蛋白免疫印跡法分別在mRNA與蛋白水平檢測在致癌過程中與FOX03a功能活性狀態(tài)相關(guān)的p27、Bim、CDK4、CDK6及cyclin D1等基因的表達變化；經(jīng)轉(zhuǎn)染FOX03a轉(zhuǎn)錄特異性DNA結(jié)合序列的熒光素酶報告基因質(zhì)粒及野生型FOX03a表達質(zhì)粒后,應用雙熒光素酶報告基因法檢測FPX03a與其轉(zhuǎn)錄啟動子特異性DNA序列的結(jié)合能力,從而探討PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導通路與FOX03a功能活性的調(diào)控作用。 3、應用小RNA干擾技術(shù)和基因克隆DNA重組技術(shù)(野生型FOXO3a/FOXO3a-WT與構(gòu)造活化型FOX03a即AKT依賴的磷酸化位點突變型/FOXO3a-3A)研究FOXOa基因表達沉默或過表達對口腔鱗癌細胞增殖、細胞凋亡、細胞周期分布等體外生物學行為及接種裸鼠皮下對體內(nèi)移植瘤成瘤能力的影響。應用Real-time PCR與蛋白免疫印跡法分別在mRNA與蛋白水平檢測在致癌過程中與FOXO3a功能活性狀態(tài)相關(guān)的p27、Bim、CDK4、CDK6及cyclin D1等基因表達,及FOXO家族中FOXO1與FOXO4的表達情況,分析上述基因表達與FOXO3a功能活性的相關(guān)性,探討FOXO3a對口腔鱗癌細胞在體內(nèi)外抑癌作用發(fā)揮的可能效應靶基因。 4、探討Cisplatin與Rapamycin分別單純或聯(lián)合處理口腔鱗癌細胞后FOXO3a基因的表達、蛋白在細胞內(nèi)定位及轉(zhuǎn)錄活性情況等,并檢測其對細胞增殖、細胞凋亡、細胞周期分布等體外生物學行為的影響,同時對FOXO3a可能的效應靶基因p27、Bim、CDK4、CDK6及cyclin D1的表達進行檢測。應用小RNA干擾沉默F(xiàn)OXO3a表達,體外篩選并培養(yǎng)穩(wěn)定沉默F(xiàn)OXO3a表達的口腔鱗癌細胞,與其父代口腔鱗癌細胞分別接種裸鼠皮下,采用Cisplatin與Rapamycin分別單獨或聯(lián)合治療移植瘤,在體內(nèi)觀察藥物對腫瘤細胞生長的作用,并探討FOXO3a功能再活化在其中所起的作用。 結(jié)果： 1、與全身其它惡性腫瘤類似,口腔鱗癌臨床組織標本中同樣發(fā)現(xiàn)FOXO3a蛋白表達水平的降低,但其mRNA表達水平無明顯變化。FOX03a蛋白表達的降低與患者的吸煙、飲酒、腫瘤大小、TNM臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理指標間未見明顯相關(guān)性,但FOXO3a蛋白表達的降低與腫瘤的病理分級及癌激酶AKT的活性蛋白p-AKT表達水平具有顯著相關(guān)性。 2、通過IGF-1處理口腔鱗癌細胞后,我們發(fā)現(xiàn)癌激酶AKT的活性蛋白p-AKT表達明顯上調(diào),當采用PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導通路抑制劑LY294002處理后,p-AKT蛋白表達則顯著降低,即證實通過上述兩種處理能夠調(diào)控PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導通路的活性。通過抑制或激活PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導通路的活性,我們發(fā)現(xiàn)FOX03a轉(zhuǎn)錄功能失活與癌激酶AKT的功能異�；罨嚓P(guān),AKT具有對胞核內(nèi)FOXO3a蛋白磷酸化修飾作用,誘導FOXO3a出核轉(zhuǎn)運,胞漿內(nèi)磷酸化的FOXO3a可能通過泛素-蛋白酶體途徑降解,最終導致口腔鱗癌細胞FOX03a蛋白表達降低,同時還發(fā)現(xiàn)口腔鱗癌細胞中AKT功能活性對FOXO3a下游與細胞周期停滯和凋亡誘導密切相關(guān)的重要靶基因Bim與p27表達的調(diào)控,此外cyclin D1、CDK4與CDK6基因表達與FOX03a功能活性可能相關(guān)。 3、口腔鱗癌細胞中過表達FOX03a-WT,可引起PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導通路的反饋性抑制,過表達AKT依賴的FOX03a三磷酸化位點(Thr32,Ser253及Ser315)突變的FOXO3a-3A可抵抗AKT的反饋性抑制。轉(zhuǎn)錄因子FOXO3a參與調(diào)控口腔鱗癌中細胞周期失控及細胞凋亡機制異常相關(guān)基因的表達,FOXO3a功能再活化后,可上調(diào)p27與Bim的mRNA與蛋白水平、下調(diào)cyclin D1的mRNA與蛋白水平、下調(diào)CDK4與CDK6蛋白水平�？谇击[癌細胞中FOXO3a功能再活化可顯著上調(diào)FOXO家族的其他兩大重要成員FOXO1與FOXO4的表達。轉(zhuǎn)錄因子FOXO3a功能活性的獲得或丟失能影響口腔鱗癌細胞的增殖、細胞周期、凋亡和裸鼠體內(nèi)移植瘤成瘤能力。 4、Cisplatin通過抑制癌激酶AKT活性蛋白p-AKT對FOXO3a的磷酸化出核轉(zhuǎn)運,可上調(diào)口腔鱗癌細胞FOXO3a表達,同時FOXO3a功能再活化介導了Cisplatin對Tca8113細胞的體內(nèi)外部分抑癌作用。Rapamycin能提高FOXO3a蛋白穩(wěn)定性,但FOXO3a蛋白表達水平卻無明顯上調(diào),同時我們還發(fā)現(xiàn)Rapamycin抑制了泛素連接酶Skp2蛋白表達,促使了癌激酶AKT反饋性活性上調(diào)。Rapamycin與Cisplatin聯(lián)用處理Tca8113細胞,在上調(diào)FOXO3a蛋白穩(wěn)定性的同時,又抑制了癌激酶AKT的反饋性激活,從而顯著上調(diào)FOX03a表達,協(xié)同再活化FOX03a功能；此外,FOXO3a功能再活化介導了由Rapamycin與Cisplatin聯(lián)用對Tca8113細胞的體內(nèi)外協(xié)同抑癌作用,而兩者聯(lián)用對FOXO3a基因表達沉默的Tca8113細胞裸鼠移植瘤模型體內(nèi)成瘤無協(xié)同抑制作用。 結(jié)論： 1、口腔鱗癌中FOX03a蛋白表達明顯降低,并且與腫瘤的病理分級顯著相關(guān),但其mRNA表達無明顯變化,進一步驗證了FOX03a基因在包括口腔鱗癌在內(nèi)的惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中不存在突變,其功能失活與翻譯后蛋白水平的復雜調(diào)控有關(guān)。 2、癌激酶AKT與FOX03a功能活性調(diào)控相關(guān),AKT通過磷酸化胞核內(nèi)FOX03a蛋白,誘導其出核轉(zhuǎn)運并降解,從而使FOX03a功能失活,證實了FOX03a功能活性與細胞周期停滯和凋亡誘導中的重要靶基因Bim、p27、cyclin D1、CDK4與CDK6等表達相關(guān)。 3、過表達FOX03a基因可引起AKT反饋性活化,構(gòu)造性活化的FOX03a能抵抗該反饋性回路調(diào)控,從而可在體內(nèi)外發(fā)揮最強大的抑癌作用。此外過表達FOX03a亦能誘導FOXO1與FOXO4表達,因此可能產(chǎn)生一系列級聯(lián)放大的抑癌作用,進一步驗證了FOXO3a可考慮作為腫瘤基因治療靶點的候選基因。 4、Rapamycin在提高FOXO3a蛋白穩(wěn)定性的同時激活了AKT的反饋性活化,Cisplatin可抑制AKT對FOXO3a的負性調(diào)控,兩者聯(lián)用在口腔鱗癌細胞FOXO3a功能再活化方面具有顯著的協(xié)同效應,處理腫瘤細胞后FOXO3a功能再活化介導了Rapamycin與Cisplatin在體內(nèi)外強大的抑癌作用�；谝种破湄撔苑答仚C制的靶向FOXO3a功能再活化將為腫瘤靶向治療提供一個合理高效的策略。
【學位單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2012
【中圖分類】：R739.8

【共引文獻】

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本文編號：2820318