先天缺牙是一種較為常見的口腔遺傳性疾病,臨床上僅僅表現(xiàn)為牙齒數(shù)目的缺失。正常人中約20%的個體有智齒缺失,其余牙缺失約在3%-10%之間,以下頜第二前磨牙、上頜側(cè)切牙多見,第一和第二恒磨牙缺失少見。研究發(fā)現(xiàn),在牙發(fā)育期環(huán)境因素,如創(chuàng)傷、感染、大劑量放療、化療等可引起缺牙,同時也有相當數(shù)量的缺牙與遺傳有關(guān)。其遺傳模式以常染色體顯性為主,而常染色體隱性和X-連鎖遺傳方式及散發(fā)病例均有報道。缺牙按缺失數(shù)目可分為少數(shù)牙缺失(少于6顆)和多數(shù)牙缺失(6顆和6顆以上),極端缺牙表現(xiàn)為全口無牙。按臨床表型可分為非綜合征型缺牙和伴其他體征的綜合征型缺牙,其中非綜合征型缺牙較常見,且有明顯遺傳異質(zhì)性。迄今為止,有證據(jù)表明家族遺傳或部分散發(fā)的非綜合型先天缺牙與MSX1、PAX9、AXIN2和EDA等基因的突變有關(guān)。 我國是多民族人口大國,和其它國家相比有不可比擬的遺傳資源優(yōu)勢,但相對國外而言,國內(nèi)對中國人非綜合征型先天缺牙的致病基因的定位較少,且分子遺傳學病因研究報道并也多見,而國外學者對中國人群中非綜合征型先天缺牙的研究報道屢見不鮮。而且隨著我國人口政策的深入實行,具有研究意義的大型先天缺牙病家系越來越少,因此在現(xiàn)階段開展先天缺牙家系的收集和保護工作,對先天缺牙疾病機制的研究以及人類牙齒發(fā)育研究等課題意義重大。 因此本研究立足于中國人群先天缺牙家系的收集和保護。對參與調(diào)查的家系,調(diào)查前每位成員均做到知情同意,并簽署知情同意書,未滿14歲的兒童由其監(jiān)護人代理。整個研究已通過武漢大學倫理委員會審查。對各家系成員進行全身健康狀況及口腔�？茩z查,了解相應(yīng)病史及疾病在各家系中的遺傳特征,對受累成員年齡、性別、臨床表現(xiàn)、X線特點進行詳細記錄和分析。繪制完整的家系圖譜,明確可能的遺傳方式。對家系中的病人及家系中直系親屬,每人采集外周靜脈血兩份,一份為EDTA抗凝,后用改良鹽析法提取外周血基因組DNA,-20℃保存；一份為肝素鈉抗凝,用于淋巴細胞建系,建系成功后液氮凍存,并由專人保管。 本研究共收集到8個多代家系,均為非綜合征型先天缺牙,其中一個家系部分患者還伴發(fā)有單側(cè)唇裂。對這8個家系的遺傳特點和表型分析后,先對4個候選基因進行突變位點的篩查,并在其中三個家系中分別發(fā)現(xiàn)了三處新的突變：兩個錯義突變L27P和I29T,均位于PAX9的成對結(jié)構(gòu)域；一個無義突變Q189X,位于MSX1的同源異形盒結(jié)構(gòu)域。這三個突變在正常人群對照中均無出現(xiàn)。對PAX蛋白的同源性分析和結(jié)構(gòu)預測提示突變可能影響蛋白功能。通過體外定點誘變技術(shù)獲得突變質(zhì)粒；將野生型與突變質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染細胞系；對于PAX9突變的功能研究：通過細胞免疫熒光和蛋白印跡對突變蛋白進行亞細胞定位,免疫熒光和蛋白印跡結(jié)果顯示,突變未改變PAX9在細胞中的定位,凝膠遷移實驗和螢光素酶分析表明突變的PAX9蛋白失去了與特定DNA序列結(jié)合的能力,同時也喪失了激活下游BMP4的能力。對于MSX1突變的功能研究：通過實時定量PCR表明突變MSX1在mRNA表達水平上顯著降低。我們的發(fā)現(xiàn)擴大了遺傳性先天缺牙PAX9和MSX1基因的突變譜,通過功能分析我們認為PAX9和MSX1的這三個突變分別是造成相應(yīng)家系中缺牙的原因。 第一部分先天缺牙家系調(diào)查和樣本收集 目的：主要收集非綜合征型先天缺牙家系,對家系成員作詳細的調(diào)查和遺傳特點分析,觀察是否存在新的疾病表型。保存人類遺傳資源,繪制完整的家系圖譜,明確可能的遺傳方式,為開展進一步的致病基因突變分析及功能研究等工作打下基礎(chǔ)。 材料和方法：通過先證者法我們現(xiàn)已收集8個多代無血緣關(guān)系的先天缺牙家系。在知情同意原則下,對上述家系成員作詳細的家系調(diào)查、口腔專科檢查和樣本采集。 結(jié)果：8個家系均為中國人漢族家系,其中家系3除單純?nèi)毖赖谋硇屯?部分患者還伴有先天性唇裂。其它7個家系均為非綜合征先天缺牙,主要累及恒牙列,無拔牙或其他導致牙齒脫落的病史,排除患者母親妊娠期患病服藥史,檢查指(趾)甲,毛發(fā),汗腺及身體其他系統(tǒng)均無異常。先天缺牙的表現(xiàn)度在不同家系及同一家系的不同個體間存在較大差異,患者的缺牙牙位和缺牙數(shù)目不同。 結(jié)論：8個家系中,除家系6不排除X連鎖遺傳外,其它家系均可確定為常染色體顯性遺傳。 第二部分先天缺牙患者候選基因突變的檢測 目的：以收集到的8個家系為研究對象,對家系患者進行候選基因MSX1、PAX9、 AXIN2和EDA的篩查,分析存在的突變類型。 材料和方法：用改良鹽析法提取外周血基因組DNA,并將相應(yīng)淋巴細胞建立細胞系永久保存；應(yīng)用Primer-blast設(shè)計針對MSX1、PAX9、AXIN2和EDA四個基因的引物,對家系患者進行候選基因PCR后直接測序,尋找突變位點,分析存在的突變類型,相應(yīng)氨基酸變化、疾病基因型與表型的相互關(guān)系,確定是否存在突變熱區(qū)。 結(jié)果：分別在三個無血緣關(guān)系的家系中發(fā)現(xiàn)了三處新的突變：兩個錯義突變L27P和I29T,均位于PAX9的成對結(jié)構(gòu)域；一個無義突變Q189X,位于MSX1的同源異形盒結(jié)構(gòu)域。這三個突變在正常人群對照中均無出現(xiàn)。其余5個家系的候選基因篩查均未發(fā)現(xiàn)可疑突變位點。 結(jié)論：這三個突變擴大了PAX9和MSX1的突變譜,且突變均位于相應(yīng)基因的重要結(jié)構(gòu)域,為下一步進行突變與疾病的關(guān)聯(lián)分析奠定了基礎(chǔ)。 第三部分PAX9和MSX1突變的功能分析 目的：對以上三個突變進行功能研究,分析其可能的致病機制 材料和方法：通過體外定點誘變技術(shù)獲得突變質(zhì)粒pCMV6-L27PPAX9-MycDdk、 pCMV6-I29TPAX9-MycDdk和pCMV6-Q189X-MSX1;將野生型與突變質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染細胞系；對于PAX9突變的功能研究：通過細胞免疫熒光和蛋白印跡對突變蛋白進行亞細胞定位；通過凝膠遷移實驗檢測突變蛋白與特定DNA的結(jié)合能力；通過雙螢光素酶分析檢測突變蛋白調(diào)控下游BMP4的能力。對于MSX1突變的功能研究：通過實時定量PCR直接檢測突變MSX1在mRNA表達水平的變化。 結(jié)果：對PAX蛋白的同源性分析和結(jié)構(gòu)預測提示突變可能影響蛋白功能。免疫熒光和蛋白印跡結(jié)果顯示,突變未改變PAX9在細胞中的定位,凝膠遷移實驗和螢光素酶分析表明突變的PAX9蛋白失去了與特定DNA序列結(jié)合的能力,同時也喪失了激活下游BMP4的能力。MSX1突變導致了終止密碼產(chǎn)生,通過實時定量PCR表明突變MSX1在mRNA表達水平上顯著降低。 結(jié)論：PAX9和MSX1的這三個突變分別是造成相應(yīng)家系中缺牙的原因
【學位單位】：武漢大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2012
【中圖分類】：R781

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本文編號：2813850