目的：用攜帶人骨保護素（human osteoprotegerin, hOPG）基因的腺病毒載體Ad5-hOPG-EGFP轉染Beagle犬自體牙周韌帶細胞（Periodontal ligament cells,PDLCs），并與引導組織再生膠原膜BME-10X復合工程化，將此復合物植入Beagle犬Ⅱ°根分叉病變區(qū)，探討hOPG基因修飾的組織工程化復合物修復自體牙周組織缺損的能力及其促進牙周組織再生的能力。 方法：1.體外分離人牙周韌帶細胞，采用改良組織塊法，分別用MEM-α、DMEM-LG和RPMll640三種培養(yǎng)基培養(yǎng)，觀察不同培養(yǎng)基對人牙周韌帶細胞體外生物學行為的影響。2.體外分離培養(yǎng)Beagle犬PDLCs，采用改良組織塊法培養(yǎng)，免疫細胞化學法鑒定細胞來源。3.體外構建攜帶hOPG基因的腺病毒載體Ad5-hOPG-EGFP，并將其轉染Beagle犬PDLCs，通過流式細胞術、RealTime PCR、ELISA以及Western Blot檢測目的基因的轉錄和表達。4.體外hOPG基因轉染Beagle犬PDLCs后，熒光倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化，MTT法描繪細胞生長曲線，流式細胞技術檢測細胞的周期變化及凋亡情況，Von Kossa染色觀察礦化結節(jié)生成，Real-time PCR法檢測轉染細胞中犬ALP、OC、BSP成骨指標的表達變化，ELISA法檢測轉染后12天內(nèi)hOPG、cRANKL/cOPG的變化情況。5.轉染hOPG基因的Beagle犬PDLCs與膠原膜BME-10X復合，采用熒光倒置相差顯微鏡、激光共聚焦掃描顯微鏡、掃描電鏡觀察兩者復合情況。6.將復合的組織工程化復合物植入16只裸鼠皮下，分別于6周、12周取材拍攝X線片及制作病理切片，HE染色觀察基因修飾的工程化復合物在體內(nèi)再生情況。7.人工構建6只Beagle犬雙側下前磨牙Ⅱ°根分叉病變模型，將轉染hOPG基因的Beagle犬PDLCs與膠原膜BME-10X復合，同時設立轉染空載及未轉染的細胞復合物組、空白膜對照組，分別植入根分叉缺損區(qū)，術后6周及12周時拍攝X線片，并于術后12周時處死動物，取受試區(qū)牙及牙槽骨，制備頰舌向病理切片，HE染色，通過測量新生牙槽骨面積、新生牙骨質面積觀察牙周組織再生情況，結果進行統(tǒng)計學分析。 結果：1.α-MEM培養(yǎng)基促進PDLCs增殖，DMEM-LG促進PDLCs分化。2.成功分離培養(yǎng)了Beagle犬PDLCs。3.通過重組腺病毒Ad5-hOPG-EGFP對Beagle犬PDLCs成功進行轉染。腺病毒轉染72h后轉染效率達到80%以上，轉染的細胞發(fā)出較強的綠色熒光。RealTime PCR、ELISA以及Western Blot檢測表明，hOPG在Beagle犬PDLCs中得到了有效表達。4.hOPG基因轉染后PDLCs形態(tài)略有變化，增殖能力及細胞周期無明顯變化，未見明顯凋亡，礦化結節(jié)增大，cALP、cOC、cBSP表達量增高，轉染后12天內(nèi)hOPG分泌量逐漸增高，cRANKL/cOPG呈下降趨勢。5.轉染細胞在膠原膜中貼附、伸展，生長良好。在激光共聚焦顯微鏡下可見發(fā)出綠色熒光的細胞附著于膠原膜，分層掃描可見各層膠原膜均有不同數(shù)量的PDLCs附著。6.細胞膠原膜復合物植入裸鼠皮下后，轉染細胞與BME-10X形成類骨質樣結構。7.動物實驗結果：hOPG-PDLCs—BME-10X組新生牙骨質長度百分比較空載-PDLCs—BME-10X組、PDLCs—BME-10X組及BME-10X組高（P0.05），而其余三組之間無顯著性差異。hOPG-PDLCs—BME-10X組、空載-PDLCs—BME-10X組及PDLCs—BME-10X組的新生牙槽骨面積百分比均較BME-10X組高（P0.05），其中hOPG-PDLCs—BME-10X組又較空載-PDLCs—BME-10X組及PDLCs—BME-10X組高（P0.05），而空載-PDLCs—BME-10X組與PDLCs—BME-10X組之間無顯著性差異。 結論：1.根據(jù)實驗要求選擇合適培養(yǎng)基。2.hOPG基因可在PDLCs中有效表達。3.hOPG基因轉染可以加速PDLCs向成骨細胞表型轉化，hOPG基因轉染的PDLCs有望成為牙周組織工程理想的種子細胞。4.hOPG基因轉染的PDLCs在膠原膜BME-10X上生長良好，hOPG基因轉染的PDLCs與膠原膜復合物有望應用于牙周組織工程。5. hOPG基因轉染的PDLCs與膠原膜復合物可以促進牙周組織缺損的再生修復，具有良好的臨床應用前景。
【學位單位】：福建醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2012
【中圖分類】：R781.4
【部分圖文】：

三組培養(yǎng)基原代細胞的游出情況

梭形生長（圖 1-1）。細胞生長到一定密度后，三組細胞均呈柵欄狀或漩渦狀生長（圖1-2）。三組細胞在細胞游出 7 至 10 天，均可傳代培養(yǎng)。但傳代后，α-MEM 和DMEM-LG 組細胞較短天數(shù)內(nèi)可以再次傳代，RPMI 1640 組則需多培養(yǎng)幾日才可再次傳代。

A：波形絲蛋白染色陽性，胞漿內(nèi)著棕色（×200）；B：角蛋白染色陰性，胞漿內(nèi)不×100)。圖 1-3 細胞來源鑒定MTT 法檢測牙周韌帶細胞的增殖曲線：比較 3 組細胞增殖情況，從第 3d 起，α-MEM 組細胞生長就顯著快于其，組間有顯著性差異（P<0.05）。第 6d 起，DMEM-LG 組和 RPMI 1640顯著性差異（P<0.05）（圖 1-4）。

【引證文獻】

相關期刊論文 前1條

1 徐曉滿;張瑞敏;;組織工程及其他技術在牙周炎治療中的研究與前景[J];中國組織工程研究;2014年02期

本文編號：2812876