牙周炎是細菌引起的炎性疾病,成年人的牙齒松動脫落大部分是由患牙周炎所致。牙周炎常規(guī)的治療是對治療局部病原因素,通過齦上、齦下潔刮治及根面平整等基礎(chǔ)治療和輔助藥物、激光治療的方法來控制臨床炎癥,甚者通過引導(dǎo)骨/組織再生等手術(shù)方式來希望達到牙周缺損有效的恢復(fù)。但是,臨床發(fā)現(xiàn)通過這些方法讓牙周軟硬組織實現(xiàn)再生療效是有限的。因此,努力獲得滿意的牙周骨缺損修復(fù)和牙周組織功能的重建,是目前大家進行大量研究的目標。而近年來組織工程技術(shù)迅猛發(fā)展,并逐漸應(yīng)用在口腔疾病研究中,利用干細胞、生長因子和三維支架材料的結(jié)合,為牙周軟、硬組織的再生提供了新的可能性。牙囊干細胞(Dental follicle stem cells,DFCs)來源于包裹在成釉器和牙乳頭周圍的牙囊組織,最終發(fā)育成牙周的支持組織。研究證實DFCs自我更新能力和體內(nèi)、外多向分化能力較強,已有學(xué)者成功誘導(dǎo)DFCs分化成成骨細胞、成神經(jīng)細胞和成脂肪細胞。作為牙周組織的前體細胞,DFCs用作牙周組織工程干細胞有一定優(yōu)勢,深入研究必將為臨床干細胞移植等技術(shù)的突破提供更多可能。骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)是調(diào)節(jié)骨骼發(fā)育和重塑的蛋白。在14種具有促成骨潛能的BMPs中,骨形態(tài)發(fā)生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)有著最強的成骨誘導(dǎo)作用,BMP9作為牙周骨再生的生長因子應(yīng)用于牙周組織工程中將大大提高成骨效果。牙周炎患者的牙周組織是處于具有炎癥的微環(huán)境中,炎癥會導(dǎo)致組織發(fā)生一系列改變而無法獲得正常的再生修復(fù)能力,所以致力于炎癥微環(huán)境來研究干細胞的生物學(xué)特性,才能了解其在更接近于實際環(huán)境下的功能改變。腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)是牙周炎組織中檢測到的最主要的炎癥因子之一,能導(dǎo)致牙槽骨吸收和膠原纖維的破壞。因此,TNF-α在牙周環(huán)境的炎性變化中起著了不可忽視的作用。我們前期實驗證明BMP9能誘導(dǎo)大鼠牙囊干細胞(rat dental follicle stem cells,rDFCs)成骨向分化,但炎癥微環(huán)境對BMP9誘導(dǎo)rDFCs成骨向分化的影響尚不清楚。干細胞的分化過程處于復(fù)雜的信號通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。而炎癥微環(huán)境下,rDFCs在成骨分化過程中涉及的信號調(diào)控機制尚未闡明,阻礙了應(yīng)用組織工程技術(shù)治療牙周炎骨缺損等新技術(shù)的發(fā)展。已有研究證實Wnt信號通路在骨的發(fā)育以及骨的再生過程中不可或缺。而也有研究表明Wnt信號通路對不同干細胞在不同環(huán)境中的調(diào)控是不盡相同的。目前對于在炎癥環(huán)境下,Wnt信號通路對BMP9細胞因子誘導(dǎo)rDFCs成骨過程的作用尚未見報道,本課題將對其進行初步研究。目的:1.體外培養(yǎng)獲取純化的rDFCs,構(gòu)建重組腺病毒骨形成蛋白9(recombinant adenoviruses expressing BMP9,AdBMP9)感染的rDFCs細胞模型。2.探討TNF-α構(gòu)建的炎癥微環(huán)境對BMP9誘導(dǎo)rDFCs的成骨分化的影響。3.探討在炎癥微環(huán)境下Wnt信號通路在BMP9誘導(dǎo)rDFCs成骨分化過程中的作用。方法:第一部分:取6 d大的SD大鼠下頜磨牙胚的牙囊組織,利用酶消化法和組織塊法獲取原代rDFCs,差速傳代法純化r DFCs。AdBMP9感染純化的第3代rDFCs,于24 h、48 h觀察綠色熒光表達。第二部分:分別用不同濃度的TNF-α(0、2.5、5、10、50 ng/ml)刺激rDFCs,在1 d、3 d、5 d、7 d進行CCK-8檢測來觀察rDFCs增殖活性以選取合適的TNF-α濃度作為后續(xù)實驗的刺激濃度。為了探究rDFCs在炎癥因子刺激后是否具有炎癥特性,以TNF-α(10 ng/m L)刺激rDFCs,通過ELISA方法檢測干預(yù)24 h再常規(guī)培養(yǎng)72 h后,rDFCs組、rDFCs+AdBMP9組、rDFCs+TNF-α組、rDFCs+AdBMP9+TNF-α組的TNF-α分泌情況。為了明確TNF-α構(gòu)建的炎癥微環(huán)境對BMP9誘導(dǎo)rDFCs成骨分化的影響,按以下分組rDFCs組、rDFCs+AdBMP9組、rDFCs+TNF-α組、rDFCs+AdBMP9+TNF-α組對細胞進行成骨誘導(dǎo),成骨誘導(dǎo)7 d后堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色觀察早期成骨,成骨誘導(dǎo)14 d后,茜素紅S染色檢測鈣鹽沉積觀察晚期成骨情況。最后利用Real Time-qPCR(RT-qPCR)檢測細胞成骨基因Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runt-related transcription factor 2,RUNX2),骨鈣素(osteocalcin,OCN),I型膠原(type 1 collagen,COL-1),ALP的表達水平。第三部分:為了探究炎癥微環(huán)境下Wnt信號通路在rDFCs經(jīng)BMP9誘導(dǎo)后的成骨分化過程中的作用,將r DFCs組、rDFCs+AdBMP9組、rDFCs+TNF-α組、rDFCs+AdBMP9+TNF-α組四組成骨誘導(dǎo)7 d后提取全蛋白,Western Blot實驗檢測Wnt經(jīng)典信號通路關(guān)鍵蛋白β-catenin,糖元合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)和非經(jīng)典信號通路關(guān)鍵因子Ca~(2+)/鈣調(diào)素依賴型蛋白激酶II(Ca~(2+)/calmodulin-dependent protein kinase II,CaMKII)與Nemo樣激酶(nemo-like kinase,NLK)的表達水平,同時RT-qPCR檢測Wnt經(jīng)典信號通路下游靶基因Cyclin D1的表達情況。結(jié)果:第一部分:構(gòu)建AdBMP9感染的rDFCs細胞模型1.成功獲得純化的第3代rDFCs,以長梭形為主。本課題組前期實驗已成功鑒定rDFCs。2.AdBMP9感染rDFCs后,rDFCs穩(wěn)定表達綠色熒光。第二部分:探討TNF-α構(gòu)建的炎癥微環(huán)境對BMP9誘導(dǎo)的rDFCs成骨分化的影響。1.高濃度TNF-α(50 ng/ml)降低rDFCs增殖活性呈時間依賴性,故為保證細胞活性,選取10 ng/ml作為刺激濃度。ELISA檢測,與沒有炎癥因子刺激對照組比較,TNF-α(10 ng/ml)刺激組rDFCs的TNF-α分泌合成量增加。2.AdBMP9誘導(dǎo)組,與沒有AdBMP9誘導(dǎo)對照組比較,ALP染色更深,鈣鹽沉積更多,成骨因子RUNX2,OCN,COL-1,ALP表達水平更高,但TNF-α刺激組與沒有TNF-α刺激對照組比較,ALP染色變淺,鈣鹽沉積減少,RUNX2,OCN,COL-1,ALP表達水平降低。第三部分:探討在炎癥微環(huán)境下Wnt信號通路在BMP9誘導(dǎo)rDFCs成骨分化過程中的作用。1.Western Blot結(jié)果提示,TNF-α模擬的炎癥微環(huán)境導(dǎo)致β-catenin表達水平升高,可降解β-catenin的GSK3-β表達量低于無炎癥因子刺激對照組。RT-q PCR結(jié)果顯示W(wǎng)nt經(jīng)典信號通路的下游靶基因Cyclin D1的表達水平上升。2.Wnt非經(jīng)典信號通路的關(guān)鍵蛋白CaMKII,NLK在有TNF-α刺激組低于無刺激對照組。結(jié)論:TNF-α刺激后的rDFCs具有炎癥特性。模擬的炎癥環(huán)境抑制了rDFCs在BMP9誘導(dǎo)下的成骨分化,這個過程中Wnt經(jīng)典信號通路被激活,而非經(jīng)典信號通路被抑制,這是引起r DFCs成骨能力下降的關(guān)鍵原因之一。可見Wnt/β-catenin通路和Wnt/Ca~(2+)通路在rDFCs的成骨分化過程中都有著它們各自重要的作用,當它們的之間所處的動態(tài)平衡被打破,就會影響干細胞的功能,這為后續(xù)實驗通過調(diào)控Wnt信號通路來恢復(fù)干細胞功能提供了理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R781.42
【部分圖文】：

通過酶消化法和組織塊法相結(jié)合獲取 rDFCs 原代細胞。細胞從貼壁的組織塊中爬出，3-4 d 時，細胞單層鋪于瓶底約 80%，細胞形態(tài)主要呈多角形和長梭形。原代細胞中間摻雜上皮細胞 (圖1.a)。經(jīng)梯度消化法傳至第3代時，細胞得到純化，rDFCs 呈成纖維細胞樣長梭形。在細胞質(zhì)中可以觀察到 1 到 3 個細胞核仁和高度密集的顆粒 (圖 1. b)。本課題組前期實驗已對 rDFCs 進行了細胞培養(yǎng)及鑒定[8]。2.2 AdBMP9 感染效率觀察在 AdBMP9 或 Ad-GFP 感染 24 h 后觀察綠色熒光，感染率約 50%， 48 h后約 80%，且細胞形態(tài)未發(fā)生明顯變化，仍為長梭形，細胞密集處相互間有融合甚至重疊生長現(xiàn)象 (圖1c-f)。綠色熒光的表達被認為是 AdBMP9 成功感染 rDFCs的標志。

b茜素紅染色（×40）

aALP染色（×100）

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 李昊;周海倫;王琪;李偉;;調(diào)節(jié)Lnk/干細胞因子-干細胞因子受體通路對糖尿病狀態(tài)骨髓間充質(zhì)干細胞成骨功能的影響[J];華西口腔醫(yī)學(xué)雜志;2015年06期

2 劉征;吳洪濤;倪亞光;尹艷桃;李順祥;廖端芳;覃麗;;Wnt5a與炎癥信號在炎癥性疾病中的交叉互動[J];生理學(xué)報;2015年04期

本文編號：2811348