細胞外基質(zhì)磷酸化糖蛋白（Matrix Extracellular Phosphoglycoprotein，MEPE）最初是由Rowe等于2000年在腫瘤相關(guān)性低血磷性骨軟化癥（oncogenichypophosphatemic osteomalacia，OHO）患者腫瘤組織的cDNA文庫中篩選發(fā)現(xiàn)并克隆得到。正常組織中MEPE在骨組織、牙齒、骨髓和大腦中表達，在肺、腎以及人胎盤中有極低水平表達。MEPE在OHO患者腫瘤組織中高表達，因此被認為是引起低血磷性骨軟化癥的調(diào)磷因子。MacDougall.M等通過RT-PCR發(fā)現(xiàn)MEPE/OF45在牙體組織尤其是成牙本質(zhì)細胞中表達，首次證實MEPE在牙本質(zhì)形成過程中表達，與牙齒硬組織發(fā)育相關(guān)；基因定位位于染色體4q21.1，是多種牙本質(zhì)發(fā)育異常疾病的可能致病基因。Hanguo Wang（王捍國）等在大鼠牙髓組織中檢測到MEPE蛋白質(zhì)的三種形式，即全長、N端和C端片段，認為牙髓細胞合成分泌的MEPE被裂解成N端和C端兩個片段分泌至牙本質(zhì)細胞外基質(zhì)，C端為其活性形式。然而，形式的蛋白質(zhì)是否具有不同作用，可否調(diào)控成牙本質(zhì)細胞的分化，如何參與牙本質(zhì)形成和礦化，尚未見報道。 本課題觀察MEPE不同片段在牙齒發(fā)育過程中的時空表達，提示其不同作用；比較MEPE不同片段在細胞增殖、分化以及牙本質(zhì)形成中的作用，確定MEPE的活性形式，進一步驗證和充實MEPE裂解活化模型，從牙本質(zhì)細胞外基質(zhì)蛋白翻譯后修飾的角度探討牙本質(zhì)形成的機制，以進一步研究MEPE在牙本質(zhì)形成以及牙本質(zhì)損傷修復中的作用和機理，為臨床上牙髓病變活髓保存治療、MEPE相關(guān)疾病的預防治療提供理論依據(jù)。研究分為以下四部分內(nèi)容： 一、MEPE不同片段在牙齒發(fā)育過程中的時空表達 本實驗大量表達、純化MEPE不同片段原核蛋白，制備特異性識別N端和C端片段的抗體，并制備小鼠牙齒發(fā)育過程中不同階段組織切片，通過免疫組織化學染色法，比較MEPE不同片段在牙齒發(fā)育過程中的時空表達模式。結(jié)果顯示在PND1牙胚未見MEPE表達，在牙齒發(fā)育早期階段（PND3）可見MEPE主要表達于成牙本質(zhì)細胞和成釉細胞，隨著牙胚發(fā)育（PND5，PND7）在以上細胞中表達減弱，在前期牙本質(zhì)中表達陽性。兩種抗體識別的N端片段和C端片段蛋白表達定位無明顯差異，提示三種形式的MEPE都可能參與牙本質(zhì)形成。 二、MEPE不同片段過表達穩(wěn)定細胞系的生物學特性比較 構(gòu)建含有不同片段MEPE基因的慢病毒載體，包裝病毒后感染成牙本質(zhì)細胞建立過表達的穩(wěn)定細胞系，比較過表達N端、C端片段的穩(wěn)定細胞系的增殖、分化、礦化能力等生物學特性，并對照過表達MEPE全長的穩(wěn)定細胞系，確定其功能性片段。結(jié)果表明，MEPE全長以及C端片段能促進細胞增殖，對于細胞分化和礦化具有抑制作用，而N段片段無明顯作用。提示MEPE通過C端片段下調(diào)成牙本質(zhì)細胞分化和礦化。 三、MEPE不同片段的細胞生物學作用 通過細胞培養(yǎng)和CCK-8檢測方法、堿性磷酸酶實驗以及茜素紅染色實驗，觀察比較了不同濃度MEPE全長及C端片段蛋白質(zhì)對成牙本質(zhì)細胞增殖活性的影響。結(jié)果顯示MEPE全長及不同濃度的C端片段對成牙本質(zhì)細胞的增殖均有促進作用，對成牙本質(zhì)細胞的堿性磷酸酶活性有抑制作用，抑制成牙本質(zhì)細胞分化和礦化能力。 實驗還采用實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)方法，用MEPE不同片段作用于礦化誘導的成牙本質(zhì)細胞，檢測整合素α2（ITGA2）、釉蛋白（ENAM）與轉(zhuǎn)化生長因子β2（TGFB2）基因在成牙本質(zhì)細胞分化過程中的表達情況，探討MEPE不同片段在成牙本質(zhì)分化過程中的作用。結(jié)果顯示MEPE全長及C端片段作用下ITGA2、ENAM表達上調(diào)，TGFB2表達下調(diào)，提示MEPE全長及C端片段可能通過調(diào)節(jié)下游信號通路而對成牙本質(zhì)細胞的增殖、分化以及牙本質(zhì)形成發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。 四．MEPE不同片段在體外牙本質(zhì)形成中的作用 利用體外羥基磷灰石礦化雙膜系統(tǒng)模型，觀察MEPE蛋白全長及C端片段在體外對磷灰石晶體形成礦化的作用。結(jié)果顯示，加入MEPE蛋白全長及C端片段后，陽離子膜表面生成了大量由彎曲的片狀晶體構(gòu)成的礦化球，并且片層狀晶體表現(xiàn)為具有一定厚度的長方體形態(tài)。而BSA及DDW對照組中則無明顯的礦化球形成，提示MEPE可能直接參與生物磷灰石晶體的成核。XRD結(jié)果顯示加入MEPE和C端片段后衍射峰強度低于DDW對照組，提示MEPE全長及C端片段具有抑制晶體生長的作用。
【學位單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2013
【中圖分類】：R780.2
【部分圖文】：

第四軍醫(yī)大學博士學位論文含有大量 N-豆蔻�；稽c，這些豆蔻�；稽c可能是含 RGD 序列的磷酸化糖的一個特點。另外 MEPE 結(jié)構(gòu)中還存在多個酶解位點，比如在 46 殘基處有一個的胰島素殘基溶酶（NEP）裂解位點，53 殘基處有前蛋白轉(zhuǎn)化酶 I 和 II（propronvertase ，PCs）的裂解位點。同時，因 PHEX 和 NEP 都同屬于 M13 zetalloendopeptidase 家族，NEP 位點可能也是 PHEX 的目標位點。MEPE 可能在酶的作用下發(fā)生裂解活化而行使其功能。MEPE 的 C 端有一段富含絲氨酸和天酸的序列（509-522 殘基），與在DSPP和DPP中出現(xiàn)的序列具有高度相似性（93%稱為 ASARM 基序（acidic serine aspartate-rich MEPE-associated motif; ASAotif）。

人MEPE完整cDNA序列

-13-圖 1 續(xù)2000 年，Petersen 等[3]在大鼠的骨髓細胞中克隆到一個新基因，其編碼的名為成骨細胞/骨細胞因子(osteoblast/osteocytefactor45，OF45)，免疫組織Northern blot 研究顯示其在骨組織中表達，尤其是骨小梁和皮質(zhì)骨中的骨細

【共引文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 周銳;蘇楠;李燦;陳思宇;謝楊麗;陳林;;小鼠脛骨骨皮質(zhì)損傷修復過程中成纖維生長因子受體的表達[J];第三軍醫(yī)大學學報;2011年10期

2 吳莉萍;凌均h

本文編號：2809230