細(xì)胞外基質(zhì)磷酸化糖蛋白（Matrix Extracellular Phosphoglycoprotein，MEPE）最初是由Rowe等于2000年在腫瘤相關(guān)性低血磷性骨軟化癥（oncogenichypophosphatemic osteomalacia，OHO）患者腫瘤組織的cDNA文庫中篩選發(fā)現(xiàn)并克隆得到。正常組織中MEPE在骨組織、牙齒、骨髓和大腦中表達(dá)，在肺、腎以及人胎盤中有極低水平表達(dá)。MEPE在OHO患者腫瘤組織中高表達(dá)，因此被認(rèn)為是引起低血磷性骨軟化癥的調(diào)磷因子。MacDougall.M等通過RT-PCR發(fā)現(xiàn)MEPE/OF45在牙體組織尤其是成牙本質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，首次證實(shí)MEPE在牙本質(zhì)形成過程中表達(dá)，與牙齒硬組織發(fā)育相關(guān)；基因定位位于染色體4q21.1，是多種牙本質(zhì)發(fā)育異常疾病的可能致病基因。Hanguo Wang（王捍國）等在大鼠牙髓組織中檢測到MEPE蛋白質(zhì)的三種形式，即全長、N端和C端片段，認(rèn)為牙髓細(xì)胞合成分泌的MEPE被裂解成N端和C端兩個(gè)片段分泌至牙本質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)，C端為其活性形式。然而，形式的蛋白質(zhì)是否具有不同作用，可否調(diào)控成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化，如何參與牙本質(zhì)形成和礦化，尚未見報(bào)道。 本課題觀察MEPE不同片段在牙齒發(fā)育過程中的時(shí)空表達(dá)，提示其不同作用；比較MEPE不同片段在細(xì)胞增殖、分化以及牙本質(zhì)形成中的作用，確定MEPE的活性形式，進(jìn)一步驗(yàn)證和充實(shí)MEPE裂解活化模型，從牙本質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白翻譯后修飾的角度探討牙本質(zhì)形成的機(jī)制，以進(jìn)一步研究MEPE在牙本質(zhì)形成以及牙本質(zhì)損傷修復(fù)中的作用和機(jī)理，為臨床上牙髓病變活髓保存治療、MEPE相關(guān)疾病的預(yù)防治療提供理論依據(jù)。研究分為以下四部分內(nèi)容： 一、MEPE不同片段在牙齒發(fā)育過程中的時(shí)空表達(dá) 本實(shí)驗(yàn)大量表達(dá)、純化MEPE不同片段原核蛋白，制備特異性識別N端和C端片段的抗體，并制備小鼠牙齒發(fā)育過程中不同階段組織切片，通過免疫組織化學(xué)染色法，比較MEPE不同片段在牙齒發(fā)育過程中的時(shí)空表達(dá)模式。結(jié)果顯示在PND1牙胚未見MEPE表達(dá)，在牙齒發(fā)育早期階段（PND3）可見MEPE主要表達(dá)于成牙本質(zhì)細(xì)胞和成釉細(xì)胞，隨著牙胚發(fā)育（PND5，PND7）在以上細(xì)胞中表達(dá)減弱，在前期牙本質(zhì)中表達(dá)陽性。兩種抗體識別的N端片段和C端片段蛋白表達(dá)定位無明顯差異，提示三種形式的MEPE都可能參與牙本質(zhì)形成。 二、MEPE不同片段過表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞系的生物學(xué)特性比較 構(gòu)建含有不同片段MEPE基因的慢病毒載體，包裝病毒后感染成牙本質(zhì)細(xì)胞建立過表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞系，比較過表達(dá)N端、C端片段的穩(wěn)定細(xì)胞系的增殖、分化、礦化能力等生物學(xué)特性，并對照過表達(dá)MEPE全長的穩(wěn)定細(xì)胞系，確定其功能性片段。結(jié)果表明，MEPE全長以及C端片段能促進(jìn)細(xì)胞增殖，對于細(xì)胞分化和礦化具有抑制作用，而N段片段無明顯作用。提示MEPE通過C端片段下調(diào)成牙本質(zhì)細(xì)胞分化和礦化。 三、MEPE不同片段的細(xì)胞生物學(xué)作用 通過細(xì)胞培養(yǎng)和CCK-8檢測方法、堿性磷酸酶實(shí)驗(yàn)以及茜素紅染色實(shí)驗(yàn)，觀察比較了不同濃度MEPE全長及C端片段蛋白質(zhì)對成牙本質(zhì)細(xì)胞增殖活性的影響。結(jié)果顯示MEPE全長及不同濃度的C端片段對成牙本質(zhì)細(xì)胞的增殖均有促進(jìn)作用，對成牙本質(zhì)細(xì)胞的堿性磷酸酶活性有抑制作用，抑制成牙本質(zhì)細(xì)胞分化和礦化能力。 實(shí)驗(yàn)還采用實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法，用MEPE不同片段作用于礦化誘導(dǎo)的成牙本質(zhì)細(xì)胞，檢測整合素α2（ITGA2）、釉蛋白（ENAM）與轉(zhuǎn)化生長因子β2（TGFB2）基因在成牙本質(zhì)細(xì)胞分化過程中的表達(dá)情況，探討MEPE不同片段在成牙本質(zhì)分化過程中的作用。結(jié)果顯示MEPE全長及C端片段作用下ITGA2、ENAM表達(dá)上調(diào)，TGFB2表達(dá)下調(diào)，提示MEPE全長及C端片段可能通過調(diào)節(jié)下游信號通路而對成牙本質(zhì)細(xì)胞的增殖、分化以及牙本質(zhì)形成發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。 四．MEPE不同片段在體外牙本質(zhì)形成中的作用 利用體外羥基磷灰石礦化雙膜系統(tǒng)模型，觀察MEPE蛋白全長及C端片段在體外對磷灰石晶體形成礦化的作用。結(jié)果顯示，加入MEPE蛋白全長及C端片段后，陽離子膜表面生成了大量由彎曲的片狀晶體構(gòu)成的礦化球，并且片層狀晶體表現(xiàn)為具有一定厚度的長方體形態(tài)。而BSA及DDW對照組中則無明顯的礦化球形成，提示MEPE可能直接參與生物磷灰石晶體的成核。XRD結(jié)果顯示加入MEPE和C端片段后衍射峰強(qiáng)度低于DDW對照組，提示MEPE全長及C端片段具有抑制晶體生長的作用。
【學(xué)位單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2013
【中圖分類】：R780.2
【部分圖文】：

第四軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文含有大量 N-豆蔻�；稽c(diǎn)，這些豆蔻�；稽c(diǎn)可能是含 RGD 序列的磷酸化糖的一個(gè)特點(diǎn)。另外 MEPE 結(jié)構(gòu)中還存在多個(gè)酶解位點(diǎn)，比如在 46 殘基處有一個(gè)的胰島素殘基溶酶（NEP）裂解位點(diǎn)，53 殘基處有前蛋白轉(zhuǎn)化酶 I 和 II（propronvertase ，PCs）的裂解位點(diǎn)。同時(shí)，因 PHEX 和 NEP 都同屬于 M13 zetalloendopeptidase 家族，NEP 位點(diǎn)可能也是 PHEX 的目標(biāo)位點(diǎn)。MEPE 可能在酶的作用下發(fā)生裂解活化而行使其功能。MEPE 的 C 端有一段富含絲氨酸和天酸的序列（509-522 殘基），與在DSPP和DPP中出現(xiàn)的序列具有高度相似性（93%稱為 ASARM 基序（acidic serine aspartate-rich MEPE-associated motif; ASAotif）。

人MEPE完整cDNA序列

-13-圖 1 續(xù)2000 年，Petersen 等[3]在大鼠的骨髓細(xì)胞中克隆到一個(gè)新基因，其編碼的名為成骨細(xì)胞/骨細(xì)胞因子(osteoblast/osteocytefactor45，OF45)，免疫組織Northern blot 研究顯示其在骨組織中表達(dá)，尤其是骨小梁和皮質(zhì)骨中的骨細(xì)

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 周銳;蘇楠;李燦;陳思宇;謝楊麗;陳林;;小鼠脛骨骨皮質(zhì)損傷修復(fù)過程中成纖維生長因子受體的表達(dá)[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2011年10期

2 吳莉萍;凌均h

本文編號：2809230