目的 1．利用同步化的Hela細胞，觀察在細胞周期不同時相，哺乳動物的雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)及其底物p70 S6K的α1、α2、β1、β2不同亞型及4EBP1的表達有何區(qū)別，從而闡明mTOR與細胞周期間的關(guān)系。 2．探討mTOR及其底物在口腔鱗狀細胞癌中的表達和意義。 3．研究mTOR／p70 S6K信號通路激活在腮腺腺泡細胞癌、腮腺腺癌發(fā)生中的作用。 4．研究mTOR／eIF-4EBP1信號通路激活在口腔粘液表皮樣癌發(fā)生中的作用。 5．通過對口腔正常組織與混合瘤、高分化粘液表皮樣癌及頰癌中M期促進因子(M-phase promoting factor，MPF)的存在狀態(tài)及活性的比較，探討MPF與口腔腫瘤的發(fā)展及惡性度之間的關(guān)系。 方法 1．Hela細胞培養(yǎng)及細胞周期同步化 Hela細胞(人宮頸癌傳代細胞系)由日本神戶大學(xué)生物信號研究中心提供。將細胞接種于含DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，稀釋到3.2×10~5。加入10％FBS 10ml，37℃過夜，加脫氧胸苷(TdR)，終濃度為2mM。繼續(xù)培養(yǎng)17小時。PBS清洗兩次，加新培養(yǎng)液，37℃9小時。加TdR，終濃度2mM，37℃15小時。再用PBS清洗兩次，加新培養(yǎng)液，37℃分別培養(yǎng)4小時、8小時、10小時、12小時、16小時，依時間順序得到各期細胞：S、G2、M1、M2、G1。 2．RT-PCR 按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說明操作，選用oligodT作引物合成第一鏈cDNA，PCR檢測mTOR、p70 S6K的不同亞型α1、α2、β1、β2和4EBP1在細胞周期各時相中的表達，瓊脂糖凝膠電泳溴化乙錠染色分析檢測表達結(jié)果。 3．Western印跡分析 吸取上清，考馬斯亮藍法測定樣品中蛋白濃度。用6%，10%，巧% SDS一PAGE電泳分離，BIORAD電泳板，雙板條件為:150V，30誠。然后轉(zhuǎn)移 到硝酸纖維素膜上，經(jīng)Zh 50V的轉(zhuǎn)印后TTBS洗膜3次，每次smin。用含 5%BSA的TTBS封閉，4℃過夜，再分別與抗mToR抗體(l:600)、抗p70 S6K抗體(1:600)、抗4EBPI抗體(1:600)室溫孵育2h，與相應(yīng)的HRP標記 的羊抗鼠的二抗(1:5000)室溫孵育lh，ECL系統(tǒng)顯影。 4.p70 S6K的活性測定 收集細胞，用PBS清洗細胞后在500川裂解緩沖液中裂解。裂解緩沖 液成份為含有10 mM potassium phosvhate/1 mM EDTA/5 mM EGTA/10 mM MgC12/5 0 mM日一腳eerophosphate/1 mM Na3VO4/2 mM DJ，Y/40卜擴nil PMSF/0.1%NP4o。提取物用c18抗體4℃孵育30min。免疫復(fù)合物與蛋 白G偶聯(lián)珠反應(yīng)30min后用裂解緩沖液洗兩次，激酶緩沖液洗一次。清洗 過后免疫復(fù)合物與含有100林M未標記ATP，200協(xié)c汀而〔，一3，P〕A，rP，125林M P70 S6K膚底物(序列:RRR此SLRA)30℃反應(yīng)3Omin，加人20閃250mM EDTA，煮沸5而n，終止反應(yīng)。離心后取25閃點于磯atman咫1強陽離子交 換濾紙(1 Cm x Zem)上，用Beekman液閃計數(shù)儀測定epm值。 5.mTOR的活性測定 方法同4，底物為P70 S6K。 6.免疫組織化學(xué)法 對口腔鱗狀細胞癌、腮腺腺泡細胞癌、腮腺腺癌組織石蠟標本進行 mToR、P70 s6K、4EBPI免疫組織化學(xué)染色，觀察其表達并分析其意義。 結(jié)果 1 .mTOR及其底物在Hela細胞不同時相的表達 RT一PCR的結(jié)果表明:在Gl、S、G2、Ml、M2幾個細胞周期時相中， mTOR的mRNA的表達無明顯變化。功TOR的底物夕0腸K的亞型al、 a2、日l、日2在M期表達均有明顯增加。4EBPI的表達在M期明顯減少。 免疫印跡的結(jié)果與RT一PCR的一致，即M期夕0 S6K的al、a2、均有增 加，4EBPI在M期減少。 活性測定表明，G2期、M期mTOR較其它期有明顯增加，4EBPI在M 期活性有所下降。 2.mTOR及其底物在口腔鱗狀細胞癌中的表達 Westem印跡的結(jié)果顯示:在高分化鱗癌及低分化鱗癌中，隨著腫瘤惡 性度的提高，mTOR、夕0 S6K的表達明顯增加，而4EBPI的表達則明顯下 降。RT一PCR、免疫組化與Westem印跡結(jié)果一致。 3 .mTo形夕。腸K信號通路在其它口腔腫瘤中的作用 RT一PCR、Westen印跡分析與免疫組化的結(jié)果一致:和正常組織相比，腮 腺腺泡細胞癌、腮腺腺癌中夕0 S6K的表達明顯增加。 4.RT一PCR與westen印跡分析的結(jié)果一致:和正常組織相比，粘液表 皮樣癌中mTOR的表達明顯增加，4EBPI的表達明顯降低。 5.MPF在口腔腫瘤及正常組織中的活性 MPF的2個亞基CdcZ及cyclinB都存在于正�？谇唤M織、混合瘤、高 分化粘液表皮樣癌及頰癌中，且腫瘤組織中的MPF量高于正常組織;腫瘤 組織中的MPF的活性量高于正常組織。頰癌較正常組織高64%，提示很可 能MPF的活性變化與腫瘤的惡性度有關(guān)。 結(jié)論 1 .mTOR、夕0 S6K、4EPBI在Hela細胞的生長中起重要的調(diào)控作用。 2.mTOR及其底物表達水平的強弱和口腔鱗狀細胞癌的分化程度密 切相關(guān)，是提示腫瘤惡性程度的生物化學(xué)指標，它很可能成為未來口腔鱗狀 細胞癌治療的重要靶向蛋白。， 3.夕0 S6K的表達增加可能是腮腺腺泡細胞癌、腮腺腺癌發(fā)生的主要 機制之一。 4.口腔粘液表皮樣癌mTOR的表達增加和4EBPI的表達明顯降低可 能是介導(dǎo)粘液表皮樣癌發(fā)生的主要機制之一。 5.MPF存在于正常組織
【學(xué)位單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2004
【中圖分類】：R739.8
【部分圖文】：

低分化口腔鱗狀細胞癌組織中功TOR的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果x4(X)

高分化口腔鱗狀細胞癌組織中mTOR的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果x400

腮腺腺泡細胞癌組織中價O腸K的免疫組化染色結(jié)果x400

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 劉奕,田玉樓,于愛鳴,劉瑩,宗志宏,于秉治;口腔腫瘤及正常組織中M期促進因子的活性[J];中華口腔醫(yī)學(xué)雜志;2002年02期

本文編號：2809358