目的 1．利用同步化的Hela細(xì)胞，觀察在細(xì)胞周期不同時(shí)相，哺乳動(dòng)物的雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)及其底物p70 S6K的α1、α2、β1、β2不同亞型及4EBP1的表達(dá)有何區(qū)別，從而闡明mTOR與細(xì)胞周期間的關(guān)系。 2．探討mTOR及其底物在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)和意義。 3．研究mTOR／p70 S6K信號通路激活在腮腺腺泡細(xì)胞癌、腮腺腺癌發(fā)生中的作用。 4．研究mTOR／eIF-4EBP1信號通路激活在口腔粘液表皮樣癌發(fā)生中的作用。 5．通過對口腔正常組織與混合瘤、高分化粘液表皮樣癌及頰癌中M期促進(jìn)因子(M-phase promoting factor，MPF)的存在狀態(tài)及活性的比較，探討MPF與口腔腫瘤的發(fā)展及惡性度之間的關(guān)系。 方法 1．Hela細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞周期同步化 Hela細(xì)胞(人宮頸癌傳代細(xì)胞系)由日本神戶大學(xué)生物信號研究中心提供。將細(xì)胞接種于含DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，稀釋到3.2×10~5。加入10％FBS 10ml，37℃過夜，加脫氧胸苷(TdR)，終濃度為2mM。繼續(xù)培養(yǎng)17小時(shí)。PBS清洗兩次，加新培養(yǎng)液，37℃9小時(shí)。加TdR，終濃度2mM，37℃15小時(shí)。再用PBS清洗兩次，加新培養(yǎng)液，37℃分別培養(yǎng)4小時(shí)、8小時(shí)、10小時(shí)、12小時(shí)、16小時(shí)，依時(shí)間順序得到各期細(xì)胞：S、G2、M1、M2、G1。 2．RT-PCR 按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說明操作，選用oligodT作引物合成第一鏈cDNA，PCR檢測mTOR、p70 S6K的不同亞型α1、α2、β1、β2和4EBP1在細(xì)胞周期各時(shí)相中的表達(dá)，瓊脂糖凝膠電泳溴化乙錠染色分析檢測表達(dá)結(jié)果。 3．Western印跡分析 吸取上清，考馬斯亮藍(lán)法測定樣品中蛋白濃度。用6%，10%，巧% SDS一PAGE電泳分離，BIORAD電泳板，雙板條件為:150V，30誠。然后轉(zhuǎn)移 到硝酸纖維素膜上，經(jīng)Zh 50V的轉(zhuǎn)印后TTBS洗膜3次，每次smin。用含 5%BSA的TTBS封閉，4℃過夜，再分別與抗mToR抗體(l:600)、抗p70 S6K抗體(1:600)、抗4EBPI抗體(1:600)室溫孵育2h，與相應(yīng)的HRP標(biāo)記 的羊抗鼠的二抗(1:5000)室溫孵育lh，ECL系統(tǒng)顯影。 4.p70 S6K的活性測定 收集細(xì)胞，用PBS清洗細(xì)胞后在500川裂解緩沖液中裂解。裂解緩沖 液成份為含有10 mM potassium phosvhate/1 mM EDTA/5 mM EGTA/10 mM MgC12/5 0 mM日一腳eerophosphate/1 mM Na3VO4/2 mM DJ，Y/40卜擴(kuò)nil PMSF/0.1%NP4o。提取物用c18抗體4℃孵育30min。免疫復(fù)合物與蛋 白G偶聯(lián)珠反應(yīng)30min后用裂解緩沖液洗兩次，激酶緩沖液洗一次。清洗 過后免疫復(fù)合物與含有100林M未標(biāo)記ATP，200協(xié)c汀而〔，一3，P〕A，rP，125林M P70 S6K膚底物(序列:RRR此SLRA)30℃反應(yīng)3Omin，加人20閃250mM EDTA，煮沸5而n，終止反應(yīng)。離心后取25閃點(diǎn)于磯atman咫1強(qiáng)陽離子交 換濾紙(1 Cm x Zem)上，用Beekman液閃計(jì)數(shù)儀測定epm值。 5.mTOR的活性測定 方法同4，底物為P70 S6K。 6.免疫組織化學(xué)法 對口腔鱗狀細(xì)胞癌、腮腺腺泡細(xì)胞癌、腮腺腺癌組織石蠟標(biāo)本進(jìn)行 mToR、P70 s6K、4EBPI免疫組織化學(xué)染色，觀察其表達(dá)并分析其意義。 結(jié)果 1 .mTOR及其底物在Hela細(xì)胞不同時(shí)相的表達(dá) RT一PCR的結(jié)果表明:在Gl、S、G2、Ml、M2幾個(gè)細(xì)胞周期時(shí)相中， mTOR的mRNA的表達(dá)無明顯變化。功TOR的底物夕0腸K的亞型al、 a2、日l、日2在M期表達(dá)均有明顯增加。4EBPI的表達(dá)在M期明顯減少。 免疫印跡的結(jié)果與RT一PCR的一致，即M期夕0 S6K的al、a2、均有增 加，4EBPI在M期減少。 活性測定表明，G2期、M期mTOR較其它期有明顯增加，4EBPI在M 期活性有所下降。 2.mTOR及其底物在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá) Westem印跡的結(jié)果顯示:在高分化鱗癌及低分化鱗癌中，隨著腫瘤惡 性度的提高，mTOR、夕0 S6K的表達(dá)明顯增加，而4EBPI的表達(dá)則明顯下 降。RT一PCR、免疫組化與Westem印跡結(jié)果一致。 3 .mTo形夕。腸K信號通路在其它口腔腫瘤中的作用 RT一PCR、Westen印跡分析與免疫組化的結(jié)果一致:和正常組織相比，腮 腺腺泡細(xì)胞癌、腮腺腺癌中夕0 S6K的表達(dá)明顯增加。 4.RT一PCR與westen印跡分析的結(jié)果一致:和正常組織相比，粘液表 皮樣癌中mTOR的表達(dá)明顯增加，4EBPI的表達(dá)明顯降低。 5.MPF在口腔腫瘤及正常組織中的活性 MPF的2個(gè)亞基CdcZ及cyclinB都存在于正�？谇唤M織、混合瘤、高 分化粘液表皮樣癌及頰癌中，且腫瘤組織中的MPF量高于正常組織;腫瘤 組織中的MPF的活性量高于正常組織。頰癌較正常組織高64%，提示很可 能MPF的活性變化與腫瘤的惡性度有關(guān)。 結(jié)論 1 .mTOR、夕0 S6K、4EPBI在Hela細(xì)胞的生長中起重要的調(diào)控作用。 2.mTOR及其底物表達(dá)水平的強(qiáng)弱和口腔鱗狀細(xì)胞癌的分化程度密 切相關(guān)，是提示腫瘤惡性程度的生物化學(xué)指標(biāo)，它很可能成為未來口腔鱗狀 細(xì)胞癌治療的重要靶向蛋白。， 3.夕0 S6K的表達(dá)增加可能是腮腺腺泡細(xì)胞癌、腮腺腺癌發(fā)生的主要 機(jī)制之一。 4.口腔粘液表皮樣癌mTOR的表達(dá)增加和4EBPI的表達(dá)明顯降低可 能是介導(dǎo)粘液表皮樣癌發(fā)生的主要機(jī)制之一。 5.MPF存在于正常組織
【學(xué)位單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2004
【中圖分類】：R739.8
【部分圖文】：

低分化口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中功TOR的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果x4(X)

高分化口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中mTOR的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果x400

腮腺腺泡細(xì)胞癌組織中價(jià)O腸K的免疫組化染色結(jié)果x400

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 劉奕,田玉樓,于愛鳴,劉瑩,宗志宏,于秉治;口腔腫瘤及正常組織中M期促進(jìn)因子的活性[J];中華口腔醫(yī)學(xué)雜志;2002年02期

本文編號：2809358