目的:1.通過腺病毒法建立過表達(dá)外源性人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶基因的牙周膜細(xì)胞系;2.與用慢病毒方法建立的過表達(dá)hTERT基因的牙周膜細(xì)胞系對(duì)比分析其成骨能力,以探索構(gòu)建高效、穩(wěn)定的更有利于牙周再生研究的牙周膜細(xì)胞系。方法:1.PCR方法擴(kuò)增hTERT基因全長(zhǎng),構(gòu)建重組腺病毒質(zhì)粒pAdpshuttle-cmv-hTERT,包裝腺病毒顆粒后感染人正常牙周膜細(xì)胞;2.檢測(cè)hTERT mRNA的表達(dá)水平;3.檢測(cè)堿性磷酸酶、骨橋素、骨鈣素、骨涎蛋白、核心結(jié)合因子和Ⅰ型膠原蛋白mRNA的表達(dá)水平;4.用成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)牙周膜細(xì)胞21天后,pH為4.1的茜素紅染液染色10分鐘,觀察礦化結(jié)節(jié)的形成;5.CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。結(jié)果:1.成功培養(yǎng)出原代牙周膜細(xì)胞;2.質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)hTERT(NM-198253.2)cDNA序列進(jìn)行對(duì)比分析,與目的序列一致,成功構(gòu)建了含hTERT基因的腺病毒顆粒并感染牙周膜細(xì)胞;3.感染細(xì)胞與正常牙周膜細(xì)胞形態(tài)相似,呈纖維狀生長(zhǎng);4.qPCR結(jié)果顯示hTERT及成骨相關(guān)基因在腺病毒介導(dǎo)牙周膜細(xì)胞中高表達(dá),與正常細(xì)胞組及慢病毒介導(dǎo)的牙周膜細(xì)胞組相比有顯著性差異;5.茜素紅染色顯示腺病毒構(gòu)建的牙周膜細(xì)胞系成骨能力更強(qiáng);6.CCK-8結(jié)果示腺病毒構(gòu)建的牙周膜細(xì)胞系增殖能力強(qiáng)。結(jié)論:通過腺病毒法成功建立了過表達(dá)hTERT的人牙周膜細(xì)胞系,有較強(qiáng)的成骨分化能力,這為研究牙周膜再生機(jī)制提供了一個(gè)理想的細(xì)胞系,同時(shí)也為牙周病的治療奠定了一定的研究基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R781.4
【部分圖文】：

究生學(xué)位論文 腺病毒介導(dǎo)過表達(dá) hTERT 牙周膜細(xì)胞系的建立過濾，接觸病毒液的物品放入 84 消毒液中集中滅LEP 管中，封口，超低溫下保存。增：吸取 1ml 病毒液再次感染細(xì)胞，同時(shí)以未作培養(yǎng) 7 天，期間若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液不足添加適量培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)染病毒顆粒的細(xì)胞細(xì)胞核變大，包漿明顯。按果ERT 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果 pshuttle-cmv-TERT 經(jīng) KpnI 和 HindIII 雙酶切鑒條亮帶（圖 2-1），與 hTERT 基因(3398bp)大小相近

圖 2-2：測(cè)序結(jié)果圖 2-3：測(cè)序結(jié)果與 hTERT（NM-198253.2）cDNA 序列進(jìn)行 Blast 對(duì)比2.3.3 同源重組腺病毒質(zhì)粒酶切鑒定pAdEasy-1+pshuttle-cmv-TERT 同源重組質(zhì)粒經(jīng) PacI 酶切后在 4.5kb 左右可見一條亮帶（圖 2-4），證明腺病毒質(zhì)粒同源重組成功。

14圖 2-3：測(cè)序結(jié)果與 hTERT（NM-198253.2）cDNA 序列進(jìn)行 Blast 對(duì)比2.3.3 同源重組腺病毒質(zhì)粒酶切鑒定pAdEasy-1+pshuttle-cmv-TERT 同源重組質(zhì)粒經(jīng) PacI 酶切后在 4.5kb 左右可見一條亮帶（圖 2-4），證明腺病毒質(zhì)粒同源重組成功。

【參考文獻(xiàn)】

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1 劉衛(wèi)鋒;劉繼華;閆慧鑫;王生黨;王W

本文編號(hào)：2809139