【摘要】： 慢性牙周炎是導(dǎo)致成人牙齒功能喪失的主要原因之一，在我國(guó)有很高的發(fā)病率，影響國(guó)民健康水平。牙周炎還可能是某些系統(tǒng)性疾病或狀況的危險(xiǎn)因素。由于牙周炎的治療目前還比較困難，因此探索預(yù)防慢性牙周炎的有效途徑具有重要意義。 慢性牙周炎是一種細(xì)菌感染性疾病，牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis，P．gingivalis)是其主要可疑致病菌，菌毛蛋白(fimbrillin，F(xiàn)imA)是細(xì)菌表面主要毒力因子之一，能夠介導(dǎo)P．gingivalis與宿主細(xì)胞及P．gingivalis與口腔內(nèi)其他細(xì)菌的粘附，并且可刺激炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生。本研究的目的就在于構(gòu)建能夠增強(qiáng)粘膜免疫應(yīng)答的抗牙齦卟啉單胞菌FimA蛋白的DNA疫苗，并觀察其對(duì)P．gingivalis引起的牙槽骨吸收的保護(hù)作用。 通過(guò)基因重組技術(shù)將FimA編碼基因插入真核表達(dá)載體pIRES，在抗原基因下游插入IL-15編碼基因，兩段基因之間利用載體自身攜帶的核糖體內(nèi)部進(jìn)入位點(diǎn)IRES連接，使得兩個(gè)基因的表達(dá)互不干擾。構(gòu)建了真核共表達(dá)質(zhì)粒pIRES-fimA：IL15，同時(shí)構(gòu)建真核表達(dá)載體pIRES-fimA。通過(guò)酶切、PCR及DNA序列測(cè)定鑒定構(gòu)建的質(zhì)粒，用Lipofectamine 2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，用Westernblot和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)驗(yàn)證了重組質(zhì)粒在哺乳動(dòng)物細(xì)胞能夠正確表達(dá)FimA和IL-15。 為研究其免疫原性，重組質(zhì)粒pIRES-fimA：IL 15與pIRES-fimA經(jīng)滴鼻免疫和肌肉注射免疫BABL／c小鼠，以間接ELISA方法檢測(cè)血清中IgG和唾液中sIgA抗體水平。發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒經(jīng)滴鼻免疫能夠激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生特異性的血清IgG和唾液IgA抗體反應(yīng)，并且pIRES-fimA：IL 15滴鼻免疫產(chǎn)生的唾液IgA抗體滴度顯著高于pIRES-fimA滴鼻免疫產(chǎn)生的唾液IgA抗體滴度。pIRES-fimA：IL 15所表達(dá)的IL-15可以作為一種輔助性的細(xì)胞因子，增強(qiáng)IgA反應(yīng)。滴鼻免疫是一種有效的粘膜免疫途徑，與pIRES-fimA：IL 15肌肉注射免疫相比，兩種方法產(chǎn)生的血清IgG反應(yīng)水平相當(dāng)，但唾液IgA反應(yīng)水平顯著高于肌肉注射。滴鼻免疫既能產(chǎn)生系統(tǒng)免疫，又能激發(fā)粘膜免疫，IL-15對(duì)于sIgA反應(yīng)有正向調(diào)節(jié)作用。 本研究以重組質(zhì)粒pIRES-fimA：IL 15作為DNA疫苗，觀察其對(duì)P．gingivalis引起的實(shí)驗(yàn)性牙周炎的保護(hù)作用。將疫苗經(jīng)滴鼻免疫Wistar大鼠，用P．gingivalis接種大鼠口腔，PCR方法檢測(cè)接種后大鼠口腔中的P．gingivalis菌。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，取大鼠頜骨去除軟組織后測(cè)量釉牙骨質(zhì)界到牙槽嵴頂?shù)木嚯x作為牙槽骨吸收情況，并做組織切片觀察組織學(xué)改變。比較實(shí)驗(yàn)前后各組大鼠體重變化，并取大鼠主要臟器做組織切片觀察有無(wú)明顯病理改變。在P．gingivalis引起的大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎模型上，pIRES-fimA：IL 15經(jīng)滴鼻免疫牙槽骨吸收量顯著小于未免疫組，同時(shí)也小于pIRES-fimA免疫組。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，pIRES-fimA：IL 15和pIRES-fimA免疫組大鼠唾液中未檢測(cè)到P．gingivalis。在實(shí)驗(yàn)前后大鼠體重增加各組之間沒(méi)有顯著差異，大鼠主要臟器也沒(méi)有明顯病理改變�；蛞呙鏿IRES-fimA：IL 15能夠?qū)．gingivalis引起的實(shí)驗(yàn)性牙周炎提供安全有效的保護(hù)。 本研究成功的構(gòu)建了FimA蛋白與IL-15真核共表達(dá)質(zhì)粒，以其作為DNA疫苗經(jīng)滴鼻免疫能夠激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生特異性的系統(tǒng)免疫應(yīng)答，又能激發(fā)粘膜免疫應(yīng)答，滴鼻免疫可以作為抗牙齦卟啉單胞菌DNA疫苗有效的粘膜免疫途徑。疫苗所表達(dá)的IL-15可以作為輔助因子增強(qiáng)sIga應(yīng)答，對(duì)P．gingivalis引起的實(shí)驗(yàn)性牙周炎提供有效的保護(hù)，為解決增強(qiáng)sIgA應(yīng)答來(lái)對(duì)牙周組織提供保護(hù)的難題提供思路。將IL-15基因加入抗牙周炎DNA疫苗中的研究國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道。滴鼻免疫無(wú)痛，易于接受，有利于疫苗的使用和推廣。本研究的結(jié)果可以為研發(fā)用于人類的有效安全防治牙周炎DNA疫苗提供依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R781.42
【圖文】：

將目的片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳，與DNA相對(duì)分子質(zhì)量Marker比較，得到目的大小片段，刀mA基因片段為 1225bp，IL一巧基因片段為489bP(圖2)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHS。感受態(tài)后的菌液涂布于LA培養(yǎng)皿上，經(jīng)37℃培養(yǎng)過(guò)夜后，未轉(zhuǎn)化的DHS。細(xì)菌不能在Amp平皿上生長(zhǎng)。所以，能在Anlp平皿上生長(zhǎng)的菌落初步認(rèn)為其含有具有Amp抗性的真核表達(dá)質(zhì)粒。將pIRES一fimA:IL15的Xhol和Mlul雙酶切產(chǎn)物(即刀蒯片段)及xbal和Notl雙酶切產(chǎn)物(即IL一巧基因片段)瓊脂糖凝膠電泳，與相對(duì)分子質(zhì)量Marker比較，得到目的大小片段(圖2)。經(jīng)博亞公司序列測(cè)定，真核表達(dá)質(zhì)粒PIRES中插入了讀碼框架正確的fimA與IL一巧基因片段。2.G418選擇培養(yǎng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，獲得陽(yáng)性克隆以 G418800mg/L選擇培養(yǎng)2周后

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本文編號(hào)：2795072