發(fā)布時(shí)間：2020-08-16 20:55

【摘要】：牙周病作為一種慢性炎癥破壞性疾病，被證明是引起成人牙齒缺失的首要致病因素，它主要累及牙槽骨、牙周膜及牙骨質(zhì)等牙周支持組織。目前，牙周組織病損后的組織重建和再生仍是困擾牙周病治療效果的主要瓶頸；近年來，組織工程技術(shù)的出現(xiàn)為牙周組織的再生和重建帶來了希望。它包括三方面要素：支架材料、生長因子和種子細(xì)胞。其中，選擇合適的種子細(xì)胞和生長因子，并確保后者對(duì)前者產(chǎn)生最佳的調(diào)控效果是其成功的關(guān)鍵。目前種子細(xì)胞種類繁多，如脂肪干細(xì)胞、骨髓基質(zhì)干細(xì)胞、牙周膜干細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞等，其中，牙周膜干細(xì)胞（periodontalligament stem cells，PDLSCs）因組織來源相近和可向牙周膜方向分化等優(yōu)勢(shì)已成為牙周組織再生的首選種子細(xì)胞。在眾多生長因子中，血管內(nèi)皮生長因子（vascularendothelial growth factor，VEGF）和堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growthfactor，F(xiàn)GF-2）作為兩種重要生長因子成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。FGF-2可促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞增殖，保持其多向分化能力。但其對(duì)干細(xì)胞成骨分化的作用存在爭議，有報(bào)道稱長期、大劑量的應(yīng)用FGF-2可抑制成骨分化，但內(nèi)源性FGF-2又對(duì)成骨分化起重要調(diào)節(jié)作用。VEGF可由間充質(zhì)干細(xì)胞分泌，能增強(qiáng)脂肪干細(xì)胞多向分化能力，并可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨及成血管分化，促進(jìn)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移。此外，鑒于這兩種因子較肯定的促間充質(zhì)干細(xì)胞成血管分化能力，二者應(yīng)用于PDLSCs是否可獲得令人滿意的促成骨分化效果，從而實(shí)現(xiàn)牙周骨和血管組織的同步再生就成為我們的關(guān)注點(diǎn)。本研究首次對(duì)這兩種生長因子不同施加方式對(duì)牙周膜干細(xì)胞基本生物學(xué)特性的影響進(jìn)行探討。 研究目的： 將FGF-2和VEGF以不同施加方式作用于牙周膜干細(xì)胞，觀察其增殖、遷移、黏附及成骨分化能力的變化，探究其促牙周再生作用機(jī)制，以期優(yōu)化生長因子施加方式，獲得更好的促牙周再生效果。 研究方法： 1、牙周膜干細(xì)胞的原代培養(yǎng)，光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞外形及克隆形成情況，流式細(xì)胞儀進(jìn)行干細(xì)胞表面分子標(biāo)志物鑒定，定向誘導(dǎo)后成骨成脂染色驗(yàn)證其多向分化能力。 2、CCK-8法測(cè)細(xì)胞生長曲線，流式細(xì)胞儀測(cè)細(xì)胞周期，結(jié)合堿性磷酸酶活性定量檢測(cè)確定兩種因子促增殖、成骨分化最佳有效濃度。 3、CCK-8法測(cè)細(xì)胞生長曲線、劃痕損傷愈合實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)觀察其增殖、遷移、黏附能力變化。 4、堿性磷酸酶定性、定量檢測(cè)，茜素紅染色，real-time RT-PCR和western blot檢測(cè)成骨相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)情況，研究其成骨分化能力變化。 5、掃描電鏡觀察經(jīng)兩種因子預(yù)處理的PDLSCs在β-TCP和Bio-Oss骨粉材料表面的黏附、伸展情況，并植入裸鼠皮下(n=10)，8周后取材行組織學(xué)觀察來評(píng)價(jià)其體內(nèi)成骨能力。 研究結(jié)果： 1、原代牙周膜干細(xì)胞貼壁生長，呈典型成纖維細(xì)胞樣外形，并且具有一定克隆形成能力；細(xì)胞體外成骨成脂誘導(dǎo)后，出現(xiàn)明顯礦化結(jié)節(jié)和脂滴；流式細(xì)胞儀顯示細(xì)胞表達(dá)STRO-1、CD146、CD105、CD90，而不表達(dá)CD34、CD14。 2、CCK-8結(jié)果顯示在2%血清濃度下，兩種因子均未表現(xiàn)出明顯促增殖效果；在10%血清濃度下，20μg/L FGF-2促增殖效果較突出；細(xì)胞周期結(jié)果顯示10μg/LVEGF可明顯升高處于活躍增殖期（S+G2M）的比例：堿性磷酸酶定量檢測(cè)表明，20μg/L FGF-2可顯著降低ALP活性，而10μg/L VEGF則顯著增強(qiáng)ALP活性。由此確定采用10%血清濃度培養(yǎng)液，20μg/L FGF-2和10μg/L VEGF作為工作濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 3、CCK-8結(jié)果顯示聯(lián)合應(yīng)用FGF-2和VEGF具有協(xié)同促增殖效果；劃痕損傷遷移愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，VEGF可促進(jìn)細(xì)胞向創(chuàng)傷部位遷移；細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)GF-2可明顯促進(jìn)細(xì)胞在聚苯乙烯材料表面的初期黏附與伸展。 4、堿性磷酸酶染色和定量檢測(cè)、茜素紅染色實(shí)驗(yàn)、real-time RT-PCR和westernblot結(jié)果顯示，F(xiàn)GF-2可明顯抑制細(xì)胞成骨分化，而VEGF可明顯促進(jìn)細(xì)胞成骨分化，二者同時(shí)施加時(shí)FGF-2的作用足以逆轉(zhuǎn)VEGF的正向調(diào)節(jié)作用，成骨前期施加FGF-2配合中后期VEGF的序列施加可呈現(xiàn)比單獨(dú)應(yīng)用VEGF更加明顯的促成骨分化效果。 5、掃描電鏡觀察，經(jīng)兩種因子預(yù)處理后，細(xì)胞在Bio-Oss骨粉表面黏附、伸展效果優(yōu)于β-TCP材料表面。 6、植入裸鼠皮下8周，細(xì)胞材料復(fù)合體HE、masson染色和免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明VEGF可促進(jìn)細(xì)胞在Bio-Oss骨粉表面形成類骨質(zhì)樣結(jié)構(gòu)，并表達(dá)成骨相關(guān)蛋白，而FGF-2組細(xì)胞幾乎無類似結(jié)構(gòu)和成骨相關(guān)蛋白表達(dá)，成骨前期施加FGF-2配合中后期VEGF的序列施加表現(xiàn)出與體外實(shí)驗(yàn)相同的較強(qiáng)促成骨分化效果。 結(jié)論 FGF-2和VEGF均可呈濃度依賴性促進(jìn)PDLSCs增殖，且受血清濃度影響，二者聯(lián)合應(yīng)用有協(xié)同作用；VEGF可增強(qiáng)細(xì)胞向創(chuàng)傷部位遷移的能力；FGF-2可促進(jìn)細(xì)胞在聚苯乙烯表面的黏附；FGF-2可明顯抑制細(xì)胞成骨分化，VEGF可明顯促進(jìn)細(xì)胞成骨分化，二者序列施加方式可表現(xiàn)出更加明顯的促成骨分化效果。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R781.4
【圖文】：

導(dǎo)液的配制：配制成含 5×10-4mol/L IBMX、1×10-4mol/L 吲 胰島素、10%胎牛血清和 10-6mol/L 地塞米松的 α-MEM 培養(yǎng)導(dǎo)：待細(xì)胞長至對(duì)數(shù)生長期，棄原液，PBS 漂洗 3 遍，加入組則加入與原培養(yǎng)液相同的新液，每孔加液 1ml。每 3d 換液。 染色：棄孔內(nèi)，PBS 洗 3 遍，4%多聚甲醛固定 30min，PBS 洗 溶液（pH=4.5）染色 20min，PBS 洗 3 遍，光鏡下觀察拍照s 的分離和純化養(yǎng)的牙周膜組織來源細(xì)胞鏡下呈簇排列，在組織塊周圍較密胞漿內(nèi)可見較大橢圓形胞核，部分胞核有較明顯核分裂象（

第四軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文 PDLSCs 相關(guān)抗原的鑒定流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，克隆細(xì)胞表面抗原 CD146、CD105、CD90 表達(dá)陽性34、CD14 表達(dá)陰性，說明本實(shí)驗(yàn)中得到的克隆化細(xì)胞屬來源于中胚層的間充胞。（圖 2）

圖 2 流式細(xì)胞儀檢測(cè) PDLSCs 表面相關(guān)抗原Cs 的克隆形成率后，PDLSCs 可形成克隆細(xì)胞簇，鏡下呈長梭形，克隆狀生長緊湊（圖 3），計(jì)數(shù)克隆數(shù)得到克隆形成率為 8.5%。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 魏鑒騰;劉明;劉海洲;趙進(jìn);肖琳;韓麗君;林秀坤;;齊墩果酸通過VEGF途徑抑制內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和管腔形成[J];藥學(xué)學(xué)報(bào);2012年11期

本文編號(hào)：2794933