【摘要】：目的口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是口腔頜面-頭頸部最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,OSCC惡性程度高,5年生存率低[1]。易發(fā)生轉(zhuǎn)移是OSCC不良預(yù)后的主要原因之一,因此,OSCC轉(zhuǎn)移的預(yù)防和治療是臨床和基礎(chǔ)研究亟待解決的問(wèn)題之一。既往關(guān)于OSCC轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究多關(guān)注OSCC細(xì)胞本身的遷移和侵襲能力,而研究證明不止是腫瘤細(xì)胞的遺傳學(xué)改變,腫瘤細(xì)胞與局部微環(huán)境相互作用與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移亦密切相關(guān)。腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(cancer-associated fibroblasts,CAFs)是腫瘤微環(huán)境中最主要的間質(zhì)細(xì)胞之一,與腫瘤發(fā)生發(fā)展與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。PTEN是重要的抑癌基因,參與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲。本研究的目的是探討CAFs調(diào)控OSCC細(xì)胞中PTEN表達(dá)的機(jī)制及其在OSCC細(xì)胞遷移和侵襲中的作用。實(shí)驗(yàn)方法1.探討CAFs是否調(diào)控OSCC細(xì)胞遷移和侵襲應(yīng)用組織塊法從OSCC組織和癌旁正常組織中分離培養(yǎng)成纖維細(xì)胞,應(yīng)用α-SMA標(biāo)記CAFs;將CAFs與癌旁正常組織中成纖維細(xì)胞(normal fibroblasts,NFs)分別與口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系CAL-27細(xì)胞共培養(yǎng),應(yīng)用transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CAL-27細(xì)胞遷移和侵襲能力,以驗(yàn)證CAFs是否調(diào)控CAL-27細(xì)胞遷移和侵襲。2.探討CAFs如何調(diào)控CAL-27細(xì)胞遷移和侵襲分離CAFs和NFs細(xì)胞條件培養(yǎng)基中外泌體,分別應(yīng)用兩種外泌體培養(yǎng)CAL-27細(xì)胞,transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CAL-27細(xì)胞遷移和侵襲能力;分別提取兩種外泌體中RNA,反轉(zhuǎn)錄后應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)miR-382-5p表達(dá),比較兩種外泌體中miR-382-5p表達(dá)量;敲除CAFs中miR-382-5p,將敲除和未敲除miR-382-5p的CAFs與CAL-27細(xì)胞共培養(yǎng),應(yīng)用transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CAL-27細(xì)胞遷移和侵襲能力,以驗(yàn)證CAFs是否通過(guò)miR-382-5p調(diào)控CAL-27細(xì)胞遷移和侵襲;將熒光標(biāo)記的miR-382-5p轉(zhuǎn)染至CAFs,并將其與CAL-27細(xì)胞共培養(yǎng),加入外泌體分泌抑制劑,檢測(cè)miR-382-5p是否通過(guò)外泌體途徑被轉(zhuǎn)運(yùn)至CAL-27細(xì)胞。3.探討miR-382-5p調(diào)控CAL-27細(xì)胞遷移和侵襲的機(jī)制在 CAL-27 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染 miR-382-5p inhibitors,檢測(cè) CAL-27 細(xì)胞中 PTEN表達(dá);在敲除 PTEN 的 CAL-27 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染 miR-382-5p inhibitors,應(yīng)用 transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CAL-27細(xì)胞遷移和侵襲能力,以驗(yàn)證miR-382-5p是否通過(guò)調(diào)控PTEN影響CAL-27細(xì)胞遷移和侵襲;構(gòu)建PTEN 3'-UTR活性報(bào)告基因,將報(bào)告基因轉(zhuǎn)染至CAL-27細(xì)胞中,檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-382-5p后PTEN 3'-UTR報(bào)告基因活性;突變報(bào)告基因上miR-382-5p識(shí)別位點(diǎn),檢測(cè)突變后是否能夠阻斷miR-382-5p對(duì)報(bào)告基因活性的調(diào)控作用。結(jié)果1.應(yīng)用組織塊法從OSCC組織和癌旁正常組織中分離培養(yǎng)成纖維細(xì)胞,免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示,OSCC組織中成纖維細(xì)胞為α-SMA染色陽(yáng)性,而癌旁正常組織中成纖維細(xì)胞為α-SMA染色陰性,Western blot結(jié)果亦顯示OSCC組織中成纖維細(xì)胞α-SMA表達(dá)量明顯高于癌旁正常組織中α-SMA表達(dá)量,提示OSCC組織中成纖維細(xì)胞為CAFs。將NFs與CAFs分別與CAL-27細(xì)胞共培養(yǎng),transwell實(shí)驗(yàn)顯示,與NFs相比,CAFs能夠明顯促進(jìn)CAL-27細(xì)胞遷移和侵襲。2.分離CAFs和NFs培養(yǎng)基中外泌體,分別用于培養(yǎng)CAL-27細(xì)胞,transwell實(shí)驗(yàn)顯示CAFs來(lái)源的外泌體較NFs來(lái)源的外泌體培養(yǎng)的CAL-27細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的遷移和侵襲能力。提取CAFs和NFs來(lái)源的外泌體中RNA,qRT-PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CAFs外泌體中miR-382-5p表達(dá)量明顯高于NFs。將敲除和未敲除miR-382-5p的CAFs與CAL-27細(xì)胞共培養(yǎng),transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,敲除miR-382-5p后,共培養(yǎng)的CAL-27細(xì)胞遷移和侵襲能力明顯減弱。將熒光標(biāo)記的miR-382-5p轉(zhuǎn)染至CAFs,并將其與CAL-27細(xì)胞共培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)miR-382-5p能夠進(jìn)入CAL-27細(xì)胞中,加入外泌體釋放抑制劑能夠明顯阻斷miR-382-5p 由 CAFs 進(jìn)入 CAL-27 細(xì)胞。3.在 CAL-27 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-382-5p inhibitors,檢測(cè) PTEN 表達(dá),qRT-PCR和 Western blot 實(shí)驗(yàn)顯示,miR-382-5p inhibitors 能夠明顯上調(diào) PTEN mRNA 和蛋白表達(dá)。敲除PTEN能夠明顯逆轉(zhuǎn)miR-382-5p inhibitors導(dǎo)致的細(xì)胞遷移和侵襲能力的減弱。構(gòu)建PTEN3'-UTR報(bào)告基因,并突變報(bào)告基因上miR-382-5p識(shí)別位點(diǎn),miR-382-5p能夠明顯下調(diào)PTEN 3'-UTR報(bào)告基因活性,而突變報(bào)告基因上miR-382-5p識(shí)別位點(diǎn)能夠阻斷miR-382-5p對(duì)PTEN 3'-UTR報(bào)告基因活性的調(diào)控作用。結(jié)論在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)口腔鱗狀細(xì)胞癌CAFs外泌體可以將miR-382-5p轉(zhuǎn)移到口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中,miR-382-5p抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中PTEN表達(dá),從而影響口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞遷移和侵襲。本研究揭示了腫瘤微環(huán)境中CAFs調(diào)控口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞遷移和侵襲的新機(jī)制,為靶向CAFs研發(fā)抗口腔鱗狀細(xì)胞癌的藥物提供了理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R739.8
【圖文】：

三、ＣＡＦｓ促進(jìn)口腔淲狀細(xì)胞癌細(xì)胞遷移和侵襲逡逑分別將ＣＡＦｓ和ＮＦｓ與口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞共培養(yǎng)，共培養(yǎng)體系懫用康寧逡逑公司細(xì)胞共培養(yǎng)板，如圖１－５所示，上室（ｕｐｐｅｒ邋ｃｈａｍｂｅｒ）培養(yǎng)ＣＡＦｓ或ＮＦｓ，逡逑下室接種ＣＡＬ－２７細(xì)胞。逡逑１８逡逑

三、ＣＡＦｓ促進(jìn)口腔淲狀細(xì)胞癌細(xì)胞遷移和侵襲逡逑分別將ＣＡＦｓ和ＮＦｓ與口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞共培養(yǎng)，共培養(yǎng)體系懫用康寧逡逑公司細(xì)胞共培養(yǎng)板，如圖１－５所示，上室（ｕｐｐｅｒ邋ｃｈａｍｂｅｒ）培養(yǎng)ＣＡＦｓ或ＮＦｓ，逡逑下室接種ＣＡＬ－２７細(xì)胞。逡逑１８逡逑

ＣＡＬ－２７細(xì)胞分為２組，ＮＦｓ－Ｃｏ組與ＮＦｓ共培養(yǎng)，ＣＡＦｓ－Ｃｏ組與，４８小時(shí)后，將兩組ＣＡＬ－２７分別進(jìn)行ｔｒａｎｓｗｅｌｌ實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)細(xì)胞遷力。圖１－６顯示，在ｔｒａｎｓｗｅｌｌ細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中，ＣＡＦｓ－Ｃｏ組較ＮＦ多的細(xì)胞穿過(guò)ｔｒａｎｓｗｅｌｌ半透膜（ｎ＝６，邋／＾〈Ｏ．ＯＳ），提示與ＣＡＦｓＬ－２７細(xì)胞遷移能力較與ＮＦｓ共培養(yǎng)的ＣＡＬ－２７細(xì)胞遷移能力增ｅｌｌ細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中，ＣＡＦｓ－Ｃｏ組較ＮＦｓ－Ｃｏ組有更多的細(xì)胞穿過(guò)ｔｒａｎ（ｎ＝６，戶＜０．０５），提示與ＣＡＦｓ共培養(yǎng)的ＣＡＬ－２７細(xì)胞侵襲能力培養(yǎng)的ＣＡＬ－２７細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)。逡逑ＮＦｓ－Ｃｏ邐ＣＡＦｓ－Ｃｏ逡逑

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