【摘要】：目的口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是口腔頜面-頭頸部最常見的惡性腫瘤之一,OSCC惡性程度高,5年生存率低[1]。易發(fā)生轉移是OSCC不良預后的主要原因之一,因此,OSCC轉移的預防和治療是臨床和基礎研究亟待解決的問題之一。既往關于OSCC轉移機制的研究多關注OSCC細胞本身的遷移和侵襲能力,而研究證明不止是腫瘤細胞的遺傳學改變,腫瘤細胞與局部微環(huán)境相互作用與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉移亦密切相關。腫瘤相關成纖維細胞(cancer-associated fibroblasts,CAFs)是腫瘤微環(huán)境中最主要的間質細胞之一,與腫瘤發(fā)生發(fā)展與轉移密切相關。PTEN是重要的抑癌基因,參與腫瘤細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲。本研究的目的是探討CAFs調控OSCC細胞中PTEN表達的機制及其在OSCC細胞遷移和侵襲中的作用。實驗方法1.探討CAFs是否調控OSCC細胞遷移和侵襲應用組織塊法從OSCC組織和癌旁正常組織中分離培養(yǎng)成纖維細胞,應用α-SMA標記CAFs;將CAFs與癌旁正常組織中成纖維細胞(normal fibroblasts,NFs)分別與口腔鱗狀細胞癌細胞系CAL-27細胞共培養(yǎng),應用transwell實驗檢測CAL-27細胞遷移和侵襲能力,以驗證CAFs是否調控CAL-27細胞遷移和侵襲。2.探討CAFs如何調控CAL-27細胞遷移和侵襲分離CAFs和NFs細胞條件培養(yǎng)基中外泌體,分別應用兩種外泌體培養(yǎng)CAL-27細胞,transwell實驗檢測CAL-27細胞遷移和侵襲能力;分別提取兩種外泌體中RNA,反轉錄后應用實時定量PCR(qRT-PCR)檢測miR-382-5p表達,比較兩種外泌體中miR-382-5p表達量;敲除CAFs中miR-382-5p,將敲除和未敲除miR-382-5p的CAFs與CAL-27細胞共培養(yǎng),應用transwell實驗檢測CAL-27細胞遷移和侵襲能力,以驗證CAFs是否通過miR-382-5p調控CAL-27細胞遷移和侵襲;將熒光標記的miR-382-5p轉染至CAFs,并將其與CAL-27細胞共培養(yǎng),加入外泌體分泌抑制劑,檢測miR-382-5p是否通過外泌體途徑被轉運至CAL-27細胞。3.探討miR-382-5p調控CAL-27細胞遷移和侵襲的機制在 CAL-27 細胞中轉染 miR-382-5p inhibitors,檢測 CAL-27 細胞中 PTEN表達;在敲除 PTEN 的 CAL-27 細胞中轉染 miR-382-5p inhibitors,應用 transwell實驗檢測CAL-27細胞遷移和侵襲能力,以驗證miR-382-5p是否通過調控PTEN影響CAL-27細胞遷移和侵襲;構建PTEN 3'-UTR活性報告基因,將報告基因轉染至CAL-27細胞中,檢測轉染miR-382-5p后PTEN 3'-UTR報告基因活性;突變報告基因上miR-382-5p識別位點,檢測突變后是否能夠阻斷miR-382-5p對報告基因活性的調控作用。結果1.應用組織塊法從OSCC組織和癌旁正常組織中分離培養(yǎng)成纖維細胞,免疫細胞化學染色顯示,OSCC組織中成纖維細胞為α-SMA染色陽性,而癌旁正常組織中成纖維細胞為α-SMA染色陰性,Western blot結果亦顯示OSCC組織中成纖維細胞α-SMA表達量明顯高于癌旁正常組織中α-SMA表達量,提示OSCC組織中成纖維細胞為CAFs。將NFs與CAFs分別與CAL-27細胞共培養(yǎng),transwell實驗顯示,與NFs相比,CAFs能夠明顯促進CAL-27細胞遷移和侵襲。2.分離CAFs和NFs培養(yǎng)基中外泌體,分別用于培養(yǎng)CAL-27細胞,transwell實驗顯示CAFs來源的外泌體較NFs來源的外泌體培養(yǎng)的CAL-27細胞表現(xiàn)出更強的遷移和侵襲能力。提取CAFs和NFs來源的外泌體中RNA,qRT-PCR實驗發(fā)現(xiàn)CAFs外泌體中miR-382-5p表達量明顯高于NFs。將敲除和未敲除miR-382-5p的CAFs與CAL-27細胞共培養(yǎng),transwell實驗結果顯示,敲除miR-382-5p后,共培養(yǎng)的CAL-27細胞遷移和侵襲能力明顯減弱。將熒光標記的miR-382-5p轉染至CAFs,并將其與CAL-27細胞共培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)miR-382-5p能夠進入CAL-27細胞中,加入外泌體釋放抑制劑能夠明顯阻斷miR-382-5p 由 CAFs 進入 CAL-27 細胞。3.在 CAL-27 細胞中轉染miR-382-5p inhibitors,檢測 PTEN 表達,qRT-PCR和 Western blot 實驗顯示,miR-382-5p inhibitors 能夠明顯上調 PTEN mRNA 和蛋白表達。敲除PTEN能夠明顯逆轉miR-382-5p inhibitors導致的細胞遷移和侵襲能力的減弱。構建PTEN3'-UTR報告基因,并突變報告基因上miR-382-5p識別位點,miR-382-5p能夠明顯下調PTEN 3'-UTR報告基因活性,而突變報告基因上miR-382-5p識別位點能夠阻斷miR-382-5p對PTEN 3'-UTR報告基因活性的調控作用。結論在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)口腔鱗狀細胞癌CAFs外泌體可以將miR-382-5p轉移到口腔鱗狀細胞癌細胞中,miR-382-5p抑制口腔鱗狀細胞癌細胞中PTEN表達,從而影響口腔鱗狀細胞癌細胞遷移和侵襲。本研究揭示了腫瘤微環(huán)境中CAFs調控口腔鱗狀細胞癌細胞遷移和侵襲的新機制,為靶向CAFs研發(fā)抗口腔鱗狀細胞癌的藥物提供了理論依據(jù)。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R739.8
【圖文】：

三、ＣＡＦｓ促進口腔淲狀細胞癌細胞遷移和侵襲逡逑分別將ＣＡＦｓ和ＮＦｓ與口腔鱗狀細胞癌細胞共培養(yǎng)，共培養(yǎng)體系懫用康寧逡逑公司細胞共培養(yǎng)板，如圖１－５所示，上室（ｕｐｐｅｒ邋ｃｈａｍｂｅｒ）培養(yǎng)ＣＡＦｓ或ＮＦｓ，逡逑下室接種ＣＡＬ－２７細胞。逡逑１８逡逑

三、ＣＡＦｓ促進口腔淲狀細胞癌細胞遷移和侵襲逡逑分別將ＣＡＦｓ和ＮＦｓ與口腔鱗狀細胞癌細胞共培養(yǎng)，共培養(yǎng)體系懫用康寧逡逑公司細胞共培養(yǎng)板，如圖１－５所示，上室（ｕｐｐｅｒ邋ｃｈａｍｂｅｒ）培養(yǎng)ＣＡＦｓ或ＮＦｓ，逡逑下室接種ＣＡＬ－２７細胞。逡逑１８逡逑

ＣＡＬ－２７細胞分為２組，ＮＦｓ－Ｃｏ組與ＮＦｓ共培養(yǎng)，ＣＡＦｓ－Ｃｏ組與，４８小時后，將兩組ＣＡＬ－２７分別進行ｔｒａｎｓｗｅｌｌ實驗，檢測細胞遷力。圖１－６顯示，在ｔｒａｎｓｗｅｌｌ細胞遷移實驗中，ＣＡＦｓ－Ｃｏ組較ＮＦ多的細胞穿過ｔｒａｎｓｗｅｌｌ半透膜（ｎ＝６，邋／＾〈Ｏ．ＯＳ），提示與ＣＡＦｓＬ－２７細胞遷移能力較與ＮＦｓ共培養(yǎng)的ＣＡＬ－２７細胞遷移能力增ｅｌｌ細胞侵襲實驗中，ＣＡＦｓ－Ｃｏ組較ＮＦｓ－Ｃｏ組有更多的細胞穿過ｔｒａｎ（ｎ＝６，戶＜０．０５），提示與ＣＡＦｓ共培養(yǎng)的ＣＡＬ－２７細胞侵襲能力培養(yǎng)的ＣＡＬ－２７細胞遷移能力增強。逡逑ＮＦｓ－Ｃｏ邐ＣＡＦｓ－Ｃｏ逡逑

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 鄭曉斌;陳作良;;口腔癌相關成纖維細胞的研究進展[J];國際口腔醫(yī)學雜志;2010年02期

2 孫鑫;何永文;;腫瘤微環(huán)境和口腔癌相關成纖維細胞[J];國際病理科學與臨床雜志;2009年04期

3 安美霞;吳開力;林少春;胡世興;;漢防己甲素對翼狀胬肉成纖維細胞基質金屬蛋白酶的影響[J];國際眼科雜志;2007年04期

4 王健;唐捷;蔣秋云;;成纖維細胞在骨創(chuàng)傷修復過程中的作用[J];中國基層醫(yī)藥;2007年08期

5 王繼峰,牛建昭;外周血中一種分泌膠原的新型細胞——循環(huán)成纖維細胞[J];解剖學報;2005年06期

6 劉強,柴家科;成纖維細胞與皮膚替代物的研究與應用[J];中華燒傷雜志;2004年04期

7 盧旭華,陳德玉,趙定麟;成纖維細胞成骨潛能的研究進展[J];骨與關節(jié)損傷雜志;2004年08期

8 蔣俊,徐nr,尚宇陽,張妍;介紹一種簡易的成纖維細胞培養(yǎng)方法[J];實用手外科雜志;2001年02期

9 張建華,蘇波,張素貞;兔角膜成纖維細胞的兩種培養(yǎng)方法[J];第二軍醫(yī)大學學報;1998年04期

10 崔玉芳,楊紅,高亞兵,熊呈琦,夏國偉,王德文;5-羥色胺對正常和受照射成纖維細胞生長的影響[J];輻射研究與輻射工藝學報;1998年03期

相關會議論文 前10條

1 李繼坤;薛小平;楊秀竹;李東華;張艷萍;郭世鐸;;中藥調控成纖維細胞活性的實驗研究[A];第七屆全國中西醫(yī)結合普通外科臨床及基礎研究學術會議論文匯編[C];2001年

2 賀倩茹;從猛;丁斐;;感覺與運動神經(jīng)成纖維細胞的蛋白質組學研究[A];中國解剖學會2019年年會論文文摘匯編[C];2019年

3 劉定志;肖衡;杜成友;羅詩樵;;腫瘤上清液激活成纖維細胞后對血管內皮生長因子-A表達影響[A];2012中國器官移植大會論文匯編[C];2012年

4 張海波;胡甜甜;吳金鵬;呂恒勇;;針灸對成纖維細胞的調節(jié)作用研究進展[A];天津市生物醫(yī)學工程學會第三十三屆學術年會論文集[C];2013年

5 李亞東;牛建昭;田如玉;李銀生;張會存;解克芳;王繼峰;;人循環(huán)成纖維細胞的分離和鑒定[A];第八屆全國中西醫(yī)結合實驗醫(yī)學研討會論文匯編[C];2006年

6 陳若澤;甘小敏;梁瑩;唐德思;莫肖敏;;成纖維細胞形態(tài)學變化的電鏡觀察[A];第五次全國電子顯微學會議論文摘要集[C];1988年

7 劉杰峰;趙超莉;龍忠恒;許幼文;謝挺;;抑瘢檫劑對成纖維細胞的生物學的作用[A];第八屆全國燒傷外科學年會論文匯編[C];2007年

8 聶倩倩;文歡;姜支農;鄧紅;;原代結直腸癌相關成纖維細胞特征分析[A];2015年浙江省醫(yī)學會病理學術年會論文匯編[C];2015年

9 楊慶;王興桂;李程;劉峰;陳波;;基本機械力學刺激對腧穴筋膜成纖維細胞力感受器分子整合素α1、α3亞基表達影響研究[A];中國針灸學會經(jīng)絡分會第十二屆全國針灸經(jīng)絡學術研討會論文集[C];2012年

10 辛國華;羅旭;張友來;萬子楊;曾元臨;;改良五黃油對成纖維細胞生長增殖的影響[A];中華醫(yī)學會燒傷外科學分會2009年學術年會論文匯編[C];2009年

相關重要報紙文章 前10條

1 首席記者 劉志勇 通訊員 劉文琴 林偉吟;精準干預成纖維細胞能抑制腫瘤[N];健康報;2018年

2 記者 劉海英;英發(fā)現(xiàn)成纖維細胞具有不同類型[N];科技日報;2013年

3 劉霞;美成功將成纖維細胞直接變?yōu)樾募〖毎鸞N];科技日報;2010年

4 記者 譚嘉 通訊員 肖鑫 王澤鋒;成纖維細胞向干細胞分化途徑找到[N];健康報;2013年

5 記者 白毅;人類成纖維細胞向視網(wǎng)膜色素上皮細胞定向轉分化首獲成功[N];中國醫(yī)藥報;2013年

6 記者 劉霞;物理特性被證實可助推細胞“返老還童”[N];科技日報;2013年

7 本報記者 王婷婷;李善剛：兩例克隆兔,一顆平常心[N];科技日報;2007年

8 暨南大學醫(yī)藥生物技術研究開發(fā)中心 李校X 姚成燦;bFGF肌膚“裝修”揭秘[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2001年

9 本報記者 孟剛;幫你認識高機能水[N];中國消費者報;2009年

10 編譯 李勇;微環(huán)境可作為抗癌藥研發(fā)新靶點[N];中國醫(yī)藥報;2013年

相關博士學位論文 前10條

1 李珊;組蛋白去乙酰化酶在特發(fā)性間質性肺炎發(fā)病機制中的初步探索[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2019年

2 李全;ADSC-exo對肉芽組織成纖維細胞增殖影響及修復裸鼠皮膚缺損的研究[D];天津醫(yī)科大學;2019年

3 王利敏;腫瘤相關成纖維細胞在非小細胞肺癌轉移及耐藥中的作用及分子機制研究[D];天津醫(yī)科大學;2019年

4 孫立平;口腔鱗癌腫瘤相關成纖維細胞外泌體中miR-188-5p調控PTEN促進細胞遷移和侵襲[D];山東大學;2019年

5 陳俞帆;Pappa2基因通過IGF信號通路影響小鼠髖關節(jié)發(fā)育[D];中國醫(yī)科大學;2019年

6 張東亞;CAFs通過lncRNALOC10050611促進OSCC發(fā)展和耐藥的研究[D];南京大學;2019年

7 李自良;PDGF-BB因子誘導口腔黏膜成纖維細胞活化的作用及機制研究[D];昆明醫(yī)科大學;2018年

8 曹黎;Ang-(1-7)通過抑制NCX1/Ca~(2+)/CaMKII通路拮抗AngⅡ誘導的成纖維細胞表型轉化的實驗研究[D];重慶醫(yī)科大學;2018年

9 李文倩;卵巢癌中腫瘤相關成纖維細胞分泌外泌體中的TGFβ1促進腫瘤細胞上皮間質轉化過程的研究[D];華中科技大學;2018年

10 吳曉東;成纖維細胞CD147分子重編程腫瘤微環(huán)境調節(jié)乳腺癌進展的功能研究[D];中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學;2018年

相關碩士學位論文 前10條

1 葉

本文編號：2791742