【摘要】：顳下頜關(guān)節(jié)紊亂�。╰emporomandibular disorder，TMD）是一種常見的口腔頜面部疾病，與咬合的關(guān)系十分密切，顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎（temporomandibular jointosteoarthritis，TMJ OA）是其中最為嚴(yán)重的一種。骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）的病理改變主要包括以軟骨細(xì)胞凋亡增加、軟骨基質(zhì)降解、炎性因子和基質(zhì)金屬蛋白酶合成增加為主的軟骨退行性變；以及軟骨下骨早期的骨吸收改變到后期骨硬化，骨贅形成等。然而，關(guān)于顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎中髁突軟骨下骨的病理改建及啟動(dòng)OA早期關(guān)節(jié)軟骨退行性變化的分子機(jī)制尚不清楚。 近年來我課題組根據(jù)一系列臨床研究結(jié)果，創(chuàng)建了高仿真的異常咬合導(dǎo)致TMJOA樣變的大鼠模型。在本研究中，我們首先采用包括活體micro-CT、組織形態(tài)學(xué)分析、實(shí)時(shí)定量PCR、免疫組織化學(xué)染色等研究手段，觀察長時(shí)間實(shí)驗(yàn)性后牙咬合紊亂導(dǎo)致TMJ OA大鼠模型軟骨下骨的動(dòng)態(tài)改建過程以及成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的活性在此改建中的變化；其次，建立了實(shí)驗(yàn)性單側(cè)前牙反牙合大鼠模型，并以形態(tài)學(xué)方法評(píng)價(jià)該模型大鼠TMJ OA病變的特征，確定該模型具有更加嚴(yán)重的OA樣病變及其作為TMJ OA研究模型的可靠性。最后，以此單側(cè)前牙反牙合模型為基礎(chǔ)，采用細(xì)胞加載（剪切力）、熒光染料攝取、siRNA干擾、ELISA和western blot等技術(shù)，研究在異常受力情況下，軟骨細(xì)胞膜上Cx43半通道在軟骨退變中的重要作用。 研究結(jié)果： 1．在后牙咬合紊亂大鼠模型中，從實(shí)驗(yàn)開始第8周起便可檢測(cè)到軟骨下骨的吸收，并在實(shí)驗(yàn)12周時(shí)達(dá)到最大值，之后骨吸收開始減少，并一直持續(xù)到實(shí)驗(yàn)后32周的觀察期內(nèi)。實(shí)驗(yàn)后期骨量開始增加，但是這種新生骨的力學(xué)性能較對(duì)照組差，且骨礦物質(zhì)密度較低。實(shí)驗(yàn)12周組TRAP陽性的破骨細(xì)胞數(shù)量較同齡對(duì)照組明顯增多，而在實(shí)驗(yàn)12周組和實(shí)驗(yàn)32周組表達(dá)osteocalcin的成骨細(xì)胞數(shù)量均多于對(duì)照組。TRAP和cathepsin K mRNA的表達(dá)在12周實(shí)驗(yàn)組顯著增加，而ALP和osteocalcinmRNA的表達(dá)在12和32周兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著增加。 2．為觀察以退行性變?yōu)橹鞯镊镣籓A樣變，我們?cè)O(shè)計(jì)了單側(cè)前牙反牙合的大鼠模型，在實(shí)驗(yàn)后2周、4周和8周進(jìn)行micro-CT掃描和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。于實(shí)驗(yàn)后2周便觀察到明顯的軟骨下骨的骨吸收，表現(xiàn)為micro-CT顯示的骨礦物質(zhì)密度和骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）明顯下降，與破骨相關(guān)的因子如RANKL、RANKL/OPG、RANK、TRAP和cathepsin K的mRNA的表達(dá)水平在2周、4周和8周均顯著增加，而與成骨相關(guān)的因子osterix、RUNX2、ALP、osteocalcin的表達(dá)在2周時(shí)明顯降低，而在4周和8周高于對(duì)照組水平。并在骨—軟骨交界處觀察到明顯的鈣鹽沉積，提示存在成熟軟骨層的異常鈣化。 3．為探討異常咬合導(dǎo)致TMJ OA樣變的分子機(jī)理，我們以實(shí)驗(yàn)性單側(cè)前牙反牙合大鼠為研究對(duì)象進(jìn)行一系列體內(nèi)外檢測(cè)。體內(nèi)研究結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)后2周、4周和8周大鼠TMJ髁突軟骨中力敏感半通道蛋白Cx43mRNA表達(dá)增加，軟骨細(xì)胞合成和分泌PGE_2的功能增強(qiáng)；體外結(jié)果顯示，大鼠髁突原代軟骨細(xì)胞在受到剪切力刺激下，Cx43表達(dá)增加，Cx43半通道開放程度增大，PGE_2合成和分泌增加，并且PGE_2的分泌可被半通道阻斷劑所抑制；在剪切力刺激下，小鼠ATDC5軟骨樣細(xì)胞也可觀察到類似的變化，并且在給予siRNA干擾Cx43表達(dá)后，觀察到PGE_2的分泌明顯減少，而合成量并無明顯改變。 由此得出以下結(jié)論： 1．咬合紊亂作用下，可導(dǎo)致TMJ髁突出現(xiàn)明顯的軟骨下骨病理改建，早期以骨吸收為主，晚期出現(xiàn)明顯的骨形成修復(fù)反應(yīng)，但是新形成骨的骨質(zhì)不佳。 2．異常咬合刺激加強(qiáng)，可致軟骨下骨吸收程度加重、出現(xiàn)時(shí)間更早，并伴有成熟軟骨區(qū)域的異常鈣化。 3．異常咬合導(dǎo)致顳下頜關(guān)節(jié)髁突軟骨出現(xiàn)退行性變的重要機(jī)理之一是髁突軟骨細(xì)胞受到了異常生物力的刺激，異常生物力作用可使髁突軟骨細(xì)胞表達(dá)Cx43的水平提高，Cx43半通道開放程度增加，PGE_2合成和分泌能力增強(qiáng)，從而引起軟骨一系列退行性改變。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R782.6
【圖文】：

-33-圖 1-1A．大鼠 TMJ 髁突活體 micro-CT 三維重建圖像，從左至右按照第 0 周~32 周的時(shí)間順序排列。其中，實(shí)驗(yàn)組（EXP）可觀察到軟骨下骨局部骨吸收現(xiàn)象，相較于其他時(shí)間點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)后 12 周骨吸收程度達(dá)到最大（箭頭所示）。B．測(cè)量髁突頭寬徑（a-b）和長徑（c-d）示意圖。（a）髁突頭內(nèi)側(cè)面的最高點(diǎn)，（b）髁突頭外側(cè)面的最高點(diǎn)，（c）髁突頭前面的最高點(diǎn)，（d）髁突頭后面的最高點(diǎn)。C．Micro-CT 分析時(shí)選擇 ROI 示意圖，將髁突頭表面三等分，ROI 分別位于中部和后部。

圖 1-2A．Micro-CT 分析顯示實(shí)驗(yàn)組在 8 周時(shí)開始出現(xiàn)明顯的骨吸收，并在 12 周達(dá)到最大值。B．12 周、32 周組大鼠 TMJ 髁突正中矢狀切片的 HE 染色，黑框內(nèi)為組織形態(tài)學(xué)分析的選擇區(qū)域。C．組織形態(tài)學(xué)分析顯示軟骨下骨的骨吸收情況（*p<0.05，**p<0.01）。3.2 破骨細(xì)胞活性對(duì)照組大鼠髁突軟骨下骨中 TRAP 陽性細(xì)胞分布很少，12 周實(shí)驗(yàn)組大鼠髁突軟骨下骨中的 TRAP 陽性細(xì)胞較對(duì)照組顯著增加（p<0.01），32 周實(shí)驗(yàn)組大鼠髁突軟骨下骨中的 TRAP 陽性細(xì)胞則回歸到對(duì)照組水平（圖 1-3B）。實(shí)時(shí)定量 PCR 結(jié)果顯示，與同齡對(duì)照組相比較，在 12 周和 32 周實(shí)驗(yàn)組髁突軟骨下骨中，RANKL mRNA 的表達(dá)顯著增加，而 OPG mRNA 表達(dá)則顯著下降，從而使得 RANKL/OPG 顯著增加（p<0.05，圖 1-3C）。實(shí)驗(yàn)組中 TRAP 和 cathepsin K mRNA的表達(dá)在 12 周顯著升高，而在 32 周時(shí)回落到對(duì)照組水平（p<0.05，圖 1-3C）。

-35-圖 1-3A．大鼠 TMJ 髁突軟骨下骨 TRAP 染色。B．計(jì)數(shù) TRAP 染色陽性且細(xì)胞核多于 3 個(gè)為破骨細(xì)胞（Oc.N）。C．實(shí)時(shí)定量 PCR 檢測(cè) TMJ 髁突軟骨下骨中的 RANKL、OPG、TRAP 和 cathepsin KmRNA 的表達(dá)（*p<0.05，**p<0.01）。3.3 成骨細(xì)胞活性O(shè)steocalcin 染色陽性細(xì)胞主要分布在大鼠髁突軟骨下骨骨小梁的表面，與對(duì)照組相比，12 周和 32 周實(shí)驗(yàn)組軟骨下骨中的 osteocalcin 陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增加（p<0.01，

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2791204