【摘要】：目的純化的人顱骨成骨細胞為陽性靶細胞,以牙齦成纖維細胞為吸附對照細胞從噬菌體十二肽庫中篩選出能與之特異性結(jié)合的多肽,即為成骨細胞特異性識別多肽,其氨基酸序列為:VLAVPWSEPGYL。本研究意在探討該多肽對人顱骨成骨細胞黏附及遷移作用的影響,并確定該多肽體外促進人顱骨成骨細胞遷移及黏附的最佳濃度,為該多肽的進一步研究提供實驗基礎。具體內(nèi)容及結(jié)果如下:1.細胞黏附實驗檢測特異性識別多肽對人顱骨成骨細胞黏附作用的影響體外常規(guī)培養(yǎng)人成骨細胞,用條件培養(yǎng)液分別稀釋成骨細胞特異性識別多肽,使其濃度分別為 10-4mol/L 組、10-5mol/L 組、10-6mol/L 組、10-7mol/L 組、10-8mol/L組,及空白對照組。分別于相應時間點(0.5h,1h,2h,4h,8h)吸棄培養(yǎng)基,采取體視學的方式,顯微鏡下計算隨機視野內(nèi)黏附的細胞數(shù)。每組計算6個視野區(qū),統(tǒng)計每組的平均值(細胞數(shù)/mm2)進行統(tǒng)計學分析。結(jié)果:在此濃度范圍內(nèi),成骨細胞特異性識別多肽對人顱骨成骨細胞黏附具有一定促進作用,其最佳有效作用濃度是10-5mol/L(P0.05)。2.細胞劃痕修復實驗及Transwell遷移實驗檢測成骨細胞特異性識別多肽對人成骨細胞遷移作用的影響2.1.細胞劃痕修復實驗體外常規(guī)培養(yǎng)人顱骨成骨細胞,不含多肽的無血清培養(yǎng)基作為對照組,實驗組分為10-4、10-5、10-6 10-7、10-8mol/L五個多肽濃度組。用消毒的2ul槍頭在鋪滿單層細胞的六孔板底表面緩慢輕柔地劃出一條筆直痕跡,分別在0,24,48小時拍照觀察細胞的相對劃痕愈合面積(=遷移前劃痕的面積-遷移后劃痕的面積),以24小時劃痕愈合面積作為統(tǒng)計學計算標準進行統(tǒng)計學分析。結(jié)果:實驗組各濃度組與對照組之間24h劃痕愈合面積的差異均有統(tǒng)計學意義(F=75.87,P0.05),與對照組及其余實驗組相比,10-4mol/l與10-5mol/l組細胞劃痕愈合面積均顯著增加(P0.05)2.2Transwell遷移實驗體外培養(yǎng)人顱骨成骨細胞,實驗分為六組,即空白對照組、10-4mol/L組、10-5mol/L 組、10-6mol/L 組、10-7mol/L 組、10-8mol/L 組。采用 transwell 小室(24孔,孔徑8.0um,聚碳酸酯膜厚度6.5mm),上室加入1×105個/ml含1%血清的細胞懸液100ul,下室按照實驗分組加入含不同濃度多肽的含30%血清培養(yǎng)液600ul,空白對照組加入不含多肽的含30%血清培養(yǎng)液600ul,72h后取出小室,對遷移至膜下細胞進行固定、染色、拍照、計數(shù),統(tǒng)計學分析所獲得的實驗數(shù)據(jù)。結(jié)果:實驗組各組細胞遷移數(shù)目均高于對照組,且差異有統(tǒng)計學意義(F=127.999,P0.05)。10-4mol/l 與 10-6mol/l 濃度組間差異無統(tǒng)計學意義(F=0.25,P0.05)。綜上,一定濃度范圍的特異性識別多肽可促進成骨細胞的黏附與遷移,且10-5mol/l濃度的促進作用最為顯著。3.Transwell遷移實驗檢測特異性識別多肽對人牙齦成纖維細胞及人骨髓基質(zhì)細胞遷移作用的影響。體外培養(yǎng)人牙齦成纖維細胞及人骨髓基質(zhì)細胞,實驗分為六組,即空白對照組、10-4mol/L 組、10-5mol/L 組、10-6mol/L 組、10-7mol/L 組、10-8mol/L 組。采用transwell小室(24孔,孔徑8.0um,聚碳酸酯膜厚度6.5mm),上室加入1×105個/ml含1%血清的細胞懸液100ul,下室按照實驗分組加入含不同濃度多肽的含10%血清培養(yǎng)液600ul,空白對照組加入不含多肽的含10%血清培養(yǎng)液600ul,24h后取出小室,對遷移至膜下細胞進行固定、染色、拍照、計數(shù),獲得的實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。結(jié)果:在此濃度范圍內(nèi),成骨細胞特異性識別多肽對人牙齦成纖維細胞遷移具有一定抑制作用,對人骨髓基質(zhì)細胞遷移具有一定的促進作用。結(jié)論成骨細胞特異性識別多肽能夠促進成骨細胞黏附及遷移。
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R783
【圖文】：

培養(yǎng)液渾濁可見相當一部分細胞懸浮于培養(yǎng)液中，未貼壁生長，細胞貼壁逡逑生長率約６０％。培養(yǎng)２４－４８ｈ后倒置顯微鏡觀察，可見細胞伸展，恢復梭形或紡錘逡逑形正常外觀，細胞較小，胞突較短，有數(shù)目不等、長短不同的胞質(zhì)突，見圖２Ａ。逡逑培養(yǎng)３－４天后倒置顯微鏡下觀察細胞呈梭形或紡錘形，有多個較長的細胞突起逡逑（２－４個），胞漿豐滿、均勻，核呈卵圓形或圓形，有１－３個核仁，核仁清晰可見，逡逑見圖２Ｂ。逡逑？邋．邋？邋＇邋．邋■邋．逡逑八，邐■邐－逡逑■＇邋－ｖ：－邋■；邋■＇邋■逡逑■逡逑NB．．邋ｍ二邐＇邋＇＾：逡逑；Ａ邐Ｂ逡逑？…．、：、二＇Ｋ．．邐■逡逑，．邐Ｖ．、，、邐，邐■邐１邋１邐，逡逑圖２倒置顯微鏡下觀察人牙齦成纖維細胞形態(tài)逡逑Ａ：邋ｘ４0；邋Ｂ：邋ｘ４0逡逑Ｆｉｇ邋２邋Ｔｈｅ邋ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ邋ｏｆ邋ＨＣＧ邋ｕｎｄｅｒ邋ｔｈｅ邋ｉｎｖｅｒｔｅｄ邋ｐｈａｓｅ邋ｃｏｎｔｒａｓｔ邋ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ．逡逑Ａ：邋ｘ４0；邋Ｂ：ｘ４0逡逑３．邋１．３．體外培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)細胞的形態(tài)學觀察逡逑人骨髓間充質(zhì)細胞購回當天

培養(yǎng)液渾濁可見相當一部分細胞懸浮于培養(yǎng)液中，未貼壁生長，細胞貼逡逑壁生長率約７０％。４８小時觀察細胞伸展恢復梭形外形，細胞貼壁增加，仍有少許逡逑細胞懸浮于培養(yǎng)液屮，見圖３邋Ａ。３天換液后倒置顯微鏡觀察，細胞基本鋪滿培養(yǎng)逡逑皿底上，細胞形態(tài)成梭形、角狀，細胞生長力旺盛，密集分布，見圖３Ｂ。逡逑２０逡逑

３．邋２不同濃度成骨細胞特異性識別多肽的配制逡逑課題組采用的成骨細胞特異性識別多肽，要求純度達到９８％以上，由生產(chǎn)方（上逡逑�？齐纳锟萍加邢薰荆┦褂茫龋校蹋煤唾|(zhì)譜進行鑒定，見圖４。該多肽按２０ｍｇ每逡逑瓶進行分裝，離心后以無水乙醇溶解后，溶液澄清透明。無水乙醇多肽溶液融入逡逑含１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培養(yǎng)液中，充分吹散混勻至培養(yǎng)液內(nèi)無結(jié)晶物質(zhì)。逡逑ｎＶ逡逑－、…逡逑１８００邐Ｉ逡逑！＜￥００逡逑１４００逡逑１２００逡逑１ＣＯＯ逡逑８００逡逑ｔｏｏ逡逑ＪＯＯ逡逑２：：邐Ｉ．邐§逡逑ｔ邐ＪＵ邐邐邋．．．ｊ邐逡逑＾＾邐ｊｉ邐ｓ邐邐ＩＡ邐ｌｉＳ邐ＬＡ邐ｇａｉｎ逡逑圖４邋ＶＬＡＶＰＷＳＥＰＧＹＬ質(zhì)譜分析報告逡逑Ｆｉｇ４邋Ｔｈｅ邋ｍａｓｓ邋ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｒｅｐｏｒｔ邋ｏｆ邋ＶＬＡＶＰＷＳＥＰＧＹ逡逑２１逡逑

【參考文獻】

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本文編號：2790677