光動力學(xué)療法對微生物及人工菌斑作用的初步研究

發(fā)布時間：2020-08-02 12:01

【摘要】：背景: 齲病是常見病、多發(fā)病,而牙菌斑生物膜是人類齲病的始動因子。細(xì)胞外多糖特別是不溶性胞外多糖對生物膜的結(jié)構(gòu)起決定作用,如:促進(jìn)細(xì)菌黏附,促進(jìn)生物膜的形成和發(fā)展,以及在疾病發(fā)生和細(xì)菌共生集聚形成中起重要作用等[1]。因此,研究細(xì)菌在生物膜狀態(tài)下胞外多糖的合成情況對研究齲病的病因及預(yù)防有重要意義。很多學(xué)者正在尋找一些新的抗菌方法預(yù)防齲病,其中應(yīng)用潛力較大的就包括光動力學(xué)療法(PDT,photodynamic therapy)。我們采用對紅光比較敏感的甲苯胺藍(lán)(TBO,Toluidine blue O)作為光敏劑[2],分析人工菌斑生物膜在1%蔗糖條件下產(chǎn)生胞外多糖的情況,并與目前臨床常用的化學(xué)處理方法進(jìn)行對比,初步探討PDT用于預(yù)防齲病的可行性。目的: 本研究將借鑒國內(nèi)、外研究成果,進(jìn)一步探索光動力學(xué)療法對常見致齲菌游離狀態(tài)下生長抑制敏感性,初步探討對牙周組織的安全性,在此基礎(chǔ)上分析人工菌斑生物膜在1%蔗糖條件下產(chǎn)生胞外多糖的情況,并與目前臨床常用的化學(xué)處理方法進(jìn)行對比,為PDT進(jìn)一步研究提供一定的理論依據(jù)。材料與方法: 1遠(yuǎn)緣鏈球菌,粘性放線菌的誘導(dǎo)。將凍干保存的菌種遠(yuǎn)緣鏈球菌(S.s)和粘性放線菌(A.v)接種于BHI培養(yǎng)基中,37℃厭氧環(huán)境(80%N_2,10%H_2,10%CO_2)培養(yǎng)48h,革蘭染色鏡檢及生化鑒定并分離,分別移取大小形態(tài)一致的菌落溶于BHI液體培養(yǎng)基中,再次接種在BHI血瓊脂培養(yǎng)基上,37℃厭氧環(huán)境(80%N_2,10%H_2,10%CO_2)培養(yǎng)48h后,按照NCCLS標(biāo)準(zhǔn)方法,用比濁儀將其調(diào)整為0.5McFarland的標(biāo)準(zhǔn)菌液(相當(dāng)于1.5×108CFU/ml)菌懸液,備用。 2遠(yuǎn)緣鏈球菌,粘性放線菌的體外抑菌實驗。在暗室中,在四十八孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加900μl不同濃度的TBO,將0.5McFarland的標(biāo)準(zhǔn)兩種細(xì)菌菌液分別稀釋100倍成1.5×106CFU/ml,取100μl菌懸液加入各孔中,根據(jù)分組情況進(jìn)行實驗后,從孔板中移取100μl液體用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋100倍,再取20ul滴于TSA瓊脂培養(yǎng)板,分區(qū)各滴3次,48h后讀取菌落計數(shù)結(jié)果。分組情況為:1組試樣作為對照組不進(jìn)行任何處理;2組試樣采用甲苯胺藍(lán)(TBO)50μg/ml,100μg/ml處理;3組試樣行二極管激光(LED)15min(相應(yīng)能量傳遞為94.5 J/cm~2),25min(相應(yīng)能量傳遞為157.5 J/cm~2)處理;4組試樣行PDT處理,即50μg/ml,100μg/ml TBO,15min,25min LED分別相互作用。 3光動力學(xué)療法作用于人工菌斑生物膜后細(xì)胞外多糖分析。 3.1人工菌斑生物膜的制備在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板兩側(cè)的孔中加入消毒后的液態(tài)瓊脂,待其硬固后,將22mm×11mm消毒后的蓋玻片垂直插入瓊脂中,每孔插3片,然后放線菌菌懸液與BM-5培養(yǎng)基按1:9(V/V)的比例混合加入6孔板中,每12h用新鮮的BM-5培養(yǎng)基換液一次,4天后同法加入乳桿菌,再經(jīng)過4天后同法同時加入變形鏈球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌,在經(jīng)過4天涂片觀察混合生物膜制備形成。分組同上單細(xì)菌敏感性實驗,加第5組試樣:0.1%洗必泰作用15 min。 3.2胞外多糖的分析將上述蓋玻片從6孔板中取出分別置于含有10ml 10g/L蔗糖的TSA液體培養(yǎng)基中,37℃厭氧培養(yǎng)18h,刮除并收集蓋玻片上的細(xì)菌連同培養(yǎng)液4℃下以750×g離心30 min,棄上清液。細(xì)菌沉淀物用5 ml蒸餾水洗滌,再離心2次,合并上清液,即水溶性多糖;水洗后的細(xì)菌加人5 ml 0.4 mol/L的NaOH洗滌,離心3次,合并上清液,即水不溶性多糖。取適量上清液,用蒽酮法測定胞外多糖的含量[3]。4光動力學(xué)療法對小鼠牙周組織的影響。將54只小鼠隨機(jī)分為9組,實驗分組為:50μg/ml,100μg/ml TBO分別聯(lián)合二極管光照(LED)15min,25min光動力療法組;15min,25min LED分別單獨輻照組,50μg/ml,100μg/ml TBO分別單獨作用組以及沒有LED和TBO作用的空白對照組。各實驗組作用后72h,切取牙周組織切片觀察。結(jié)果: 1遠(yuǎn)緣鏈球菌抑菌率:TBO 50μg/ml,作用15min、25min抑菌率分別是89.13%、91.30%。TBO 100μg/ml,作用15min、25min抑菌率分別是94.02%、96.20%,單因素析因方差分析后F=2.88 P0.05,存在交互效應(yīng)。放線菌抑菌率:TBO 50ug/ml,作用15min、25min抑菌率分別是64.71%、91.18%。TBO 100ug/ml,作用15min、25min抑菌率分別是91.18%、88.24%,單因素析因方差分析后F=9.95 P0.05,存在交互效應(yīng)。 2經(jīng)過PDT作用后,水不溶性胞外多糖:各組和對照組均無顯著性差異(P0.05),洗必泰組和對照組有顯著性差異(P0.05);水不溶性葡聚糖:各組和對照組均無顯著性差異(P0.05),洗必泰組和對照組有顯著性差異(P0.05)。 3 72 h內(nèi),各組小鼠均無死亡、驚厥、呼吸抑制、腹瀉等,牙齦未見炎癥,潰瘍,增生等改變,進(jìn)食正常。經(jīng)過TBO不同劑量和二極管激光照射不同時間的小鼠牙齦上皮組織,結(jié)締組織,骨組織均完整,鏡下未見異常改變,與對照組表現(xiàn)相同,未見如炎癥,增生,潰瘍,壞死,血管破壞等軟組織異常,而且牙齒,牙槽骨未見異常。結(jié)論: 1光動力學(xué)療法對游離狀態(tài)的遠(yuǎn)緣鏈球菌和粘性放線菌抑菌率達(dá)到90%以上提示光動力學(xué)療法是敏感的。 2本研究表明PDT不能像0.1%洗必泰明顯減少胞外多糖的量,且不能完全殺死細(xì)菌,說明PDT對細(xì)菌的作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于0.1%洗必泰,我們認(rèn)識到PDT雖然能抑制部分細(xì)菌,但是幾小時后就可能恢復(fù)到原來的水平,但是0.1%洗必泰可以應(yīng)用到家庭護(hù)理治療,因此關(guān)于PDT仍然需要大量的改進(jìn)研究。 3光動力學(xué)療法對小鼠牙周組織未見明顯異常。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R781.1
【圖文】：

牙周組織,蘇木精-伊紅染色,致齲菌

Figure 1 Histological observation of the periodontal tissues under light microscope（HEstaining，×200）圖1 各組牙周組織觀察（蘇木精-伊紅染色，×200）3 討論很多文獻(xiàn)報道采用不同的 TBO 質(zhì)量濃度和二極管激光照射劑量會導(dǎo)致對口腔致齲菌的抑制率有所差異，但都表明同樣的試劑濃度能夠在抑制致齲菌的同時而

光動力學(xué)療法,敏感性,照片圖