【摘要】： 氧自由基生物學是一門新興的學科，目前的研究發(fā)現(xiàn)氧自由基參與許多疾病的發(fā)病機制，抗氧化劑又可用于許多與氧自由基損傷有關(guān)的疾病的防治，具有重大的實用性。因而自由基生物學與醫(yī)學緊密相聯(lián)，成為一個十分活躍的研究領(lǐng)域。口腔慢性炎癥性疾病和骨吸收相關(guān)的病理過程都有氧自由基的參與。 牙缺損或缺失后常用金屬或包含金屬的材料進行修復。非貴金屬材料因價格便宜，又具有良好的機械性能，在臨床上廣泛運用。臨床上經(jīng)�？梢钥吹酱饔眯迯腕w一段時間后出現(xiàn)牙齦著色、增生、紅腫乃至局限性牙周炎或種植體周圍炎的發(fā)生。在各種影響修復體周圍組織健康的因素中，修復用合金的影響受到越來越多的關(guān)注。這些合金在口腔潮濕環(huán)境緩慢釋放出金屬離子，一定濃度的金屬離子對口腔軟硬組織可產(chǎn)生毒性作用。近年的研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)過渡金屬離子可能影響單核細胞、成纖維細胞等多種細胞內(nèi)氧化還原反應(yīng)，引起細胞的氧化應(yīng)激，進而影響細胞的形態(tài)、增殖和分化。成骨細胞是參與骨重建的重要細胞，成骨細胞的功能狀態(tài)是影響牙周健康的重要因素。有關(guān)金屬離子對成骨細胞的毒性作用以及與氧化應(yīng)激之間關(guān)系的研究，目前尚未見報道。鉻離子是修復用生物合金的基本組分之一，鉻與許多疾病和損傷密切相關(guān)。鉻離子的生物毒性機制是否與刺激組織細胞產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species，ROS)，引起氧化應(yīng)激有關(guān)，是學者們的研究熱點，但具體機制仍不十分清楚。本課題針對相關(guān)內(nèi)容，以人成骨樣細胞株MG63為研究對象，分三部分進行了探討。 1氧化應(yīng)激對人成骨樣細胞MG63活性的影響 利用黃嘌呤／黃嘌呤氧化酶(xanthine／xanthine oxidase，X／XO)的酶促反應(yīng)生成超氧陰離子自由基刺激MG63細胞，成功建立了成骨細胞氧化應(yīng)激模型，運用氧化敏感性熒光探針DCFH-DA結(jié)合流式細胞術(shù)檢測了細胞內(nèi)ROS的生成，用倒置顯微鏡和MTT實驗觀察研究氧化應(yīng)激對成骨細胞形態(tài)和增殖活力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，X／XO處理后細胞形態(tài)發(fā)生明顯破壞，細胞增殖活力明顯降低，且隨處理濃度增大、時間延長，細胞內(nèi)ROS的生成量越大，細胞增殖活力降低更明顯。XO的抑制劑Oxypurinol在抑制細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的同時，也拮抗了X／XO引起的成骨細胞毒性。提示氧化應(yīng)激可以破壞成骨細胞形態(tài)，抑制成骨細胞增殖活力。 2鉻離子對人成骨樣細胞MG63的毒性作用 5-20μM的Cr~(6+)和Cr~(3+)刺激MG63細胞，定量研究不同價態(tài)的鉻離子對MG63細胞的毒性作用。用抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-cysteine，NAC)預處理細胞，觀察它們對鉻離子引起的成骨細胞毒性作用的拮抗效應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Cr~(6+)對MG63細胞具有明顯的細胞毒性，抑制成骨細胞增殖活力和堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性，破壞細胞正常形態(tài)和亞結(jié)構(gòu)。Cr~(3+)對MG63細胞的活性沒有明顯的影響。1-5mM的抗氧化劑NAC可以抑制Cr~(6+)引起的成骨細胞毒性。為進一步研究氧化應(yīng)激在鉻離子引起的成骨細胞毒性機制中的作用提供相應(yīng)的實驗基礎(chǔ)。 3鉻離子作用下的人成骨樣細胞MG63的氧化應(yīng)激 用5-20μM的鉻離子對MG63細胞染毒，氧化敏感性熒光探針DCFH-DA結(jié)合流式細胞術(shù)及MDA實驗檢測不同價態(tài)、不同濃度鉻離子對MG63細胞內(nèi)ROS生成的影響和細胞脂質(zhì)過氧化損傷程度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：5-20μM Cr~(6+)染毒1h后細胞內(nèi)ROS的生成明顯增加，高濃度組比低濃度組ROS生成更多；10μM Cr~(6+)染毒15-120min，引起MG63細胞內(nèi)ROS的大量生成，且隨著染毒時間的延長，細胞內(nèi)ROS的生成量也越多；5-20μM Cr~(6+)染毒24h和72h引起MG63細胞脂質(zhì)過氧化損傷，Cr~(6+)濃度越高、染毒時間越長，細胞脂質(zhì)過氧化損傷程度越高；1-5mM的抗氧化劑NAC可以抑制Cr~(6+)引起的MG63細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生和脂質(zhì)過氧化損傷；5-20μM的Cr~(3+)對MG63細胞內(nèi)ROS的生成和脂質(zhì)過氧化損傷程度無明顯影響。上述結(jié)果提示，Cr~(6+)刺激MG63細胞內(nèi)ROS大量生成，引起細胞的氧化應(yīng)激；抗氧化劑NAC可以抑制Cr~(6+)引起的MG63細胞氧化應(yīng)激性損傷。 綜上所述，本實驗的研究結(jié)果顯示，Cr~(6+)對人成骨樣細胞MG63具有明顯的細胞毒性，其毒性機制與刺激細胞內(nèi)ROS生成，引起成骨細胞氧化應(yīng)激有關(guān)。結(jié)合自由基生物學相關(guān)理論和本實驗的研究結(jié)果推測，Cr~(6+)引起細胞內(nèi)ROS生成的原因可能是Cr~(6+)催化細胞內(nèi)Fenton反應(yīng)，引起最具損傷性的自由基·OH大量生成所致。
【學位授予單位】：四川大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R78
【圖文】：

四川大學華西口腔醫(yī)學院博士學位論文DMSO溶解紫色結(jié)晶物并混勻，上機測定OD值圖2一1一 1MTT實驗中的%孔板FigZ小 1The96一 wellsPlateinMTTassay 1.2.2 1.2.2.1ALP活性的檢測測定原理如下:_._I，___~_人二___ALP_:_，，_一~，_、，_，、二對們基本瞬酸鹽+H20__盯娟量本附+僻酸盆<李二二二共> 1.2.2.2試劑成分及其濃度如下:試劑I(Rl)對硝基苯磷酸鹽16~o鞏試劑n(Rn)2一氨基一2一甲基一1一丙醇緩沖液(PH10.5)350mm0比 MgelZ2.Ommol/L1.2.2.3實驗分組及樣本收集實驗分為9個組，即空白對照組、5哪c產(chǎn)組、10州c產(chǎn)組、20州c滬+組、5哪er3+組、 looMer3+組、20州er3+組、2咖取e+10州er6+組、ZmMNAc單獨處理組。其中， ZmMNAc+l0哪c護+組為 2mMNAc預處理細胞30min后再更換含10州c產(chǎn)的F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。以上各組分別在染毒24h和72h后收集細胞進行檢測。每組在每個檢測時間點設(shè)3個復組。MG63細胞以 1x105個加工接種于6孔板上(每孔ZmL)

(((△A/min)，乘以 以系系數(shù) 0.66555圖2一1一 2ALP活性檢測實驗流程FigZ小 2Theflowehartof從 Pactivityassay1.2.2.5細胞內(nèi)總蛋白含量測定采用考馬斯亮蘭測定法測定細胞內(nèi)總蛋白含量。具體操作步驟如下:①用熒光(485/535nln)對HTS7000Plus實驗用微板進行板掃描，以確定板孔的中心位置。②HTS7O00Plus上編制檢測程序:波長59Onm，每孔讀取4個點，原始數(shù)據(jù)為四個點的均值，設(shè)讀數(shù)前低頻弧形振蕩105。③用緩沖液將標準牛血清白蛋白(3mg/mL)作對倍稀釋成7個梯度(3mg加L一Omg/inL)。④作盤圖設(shè)計。用十二通道加樣槍及配套加樣頭按盤圖位置上樣。分別

用1一 smMNAC單獨處理MG63細胞后，OD值與對照組之間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，表明NAC單獨處理對MG63增殖活力無明顯影響(圖2一1一4)。圖2一l一5為1一 5mMNAe預處理Mo63細胞對looM的er6+細胞毒性的影響。單因素方差分析顯示， zmMNAe+10拼 Mer6+24h組oD值與 looMer6+單獨處理

【引證文獻】

相關(guān)博士學位論文 前1條

1 史瑞新;弱激光照射對受張力的成骨樣細胞的早期影響及信號轉(zhuǎn)導機制的研究[D];吉林大學;2011年

相關(guān)碩士學位論文 前2條

1 熊v

本文編號：2773626