【摘要】：研究背景： 唾液腺腺樣囊性癌(adenoid cystic carcinoma of salivary glands, ACCs)是常見的涎腺上皮來源的惡性腫瘤,其具有局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率低,而嗜神經(jīng)性侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率高兩大生物學(xué)特性,其局部神經(jīng)侵襲和10年遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移分別高達(dá)50%和30-40%,單純手術(shù)治療往往不能根治腫瘤。對(duì)于腫瘤大于4cm、臨床分期晚期(Ⅲ期或Ⅳ期)及有神經(jīng)侵犯者施行術(shù)后放療,可在一定程度上降低腫瘤的局部復(fù)發(fā)率,但效果不盡如人意。因此如何利用基因治療的方法,提高唾液腺腺樣囊性癌對(duì)放射治療的敏感性,從而提高腺樣囊性癌的局部控制率和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率,進(jìn)一步提高晚期惡性腫瘤的治療的成功率和患者的生存質(zhì)量成為現(xiàn)階段國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究的熱點(diǎn)。由于NF-κB信號(hào)通路的持續(xù)性激活在腫瘤細(xì)胞的抗凋亡機(jī)制中發(fā)揮重要的作用,與腫瘤細(xì)胞的放射抵抗作用密切相關(guān),因此,通過基因工程技術(shù)抑制此通路或許可以顯著提高腫瘤的放療敏感性,從而提高腺樣囊性癌的放射治療療效。 研究目的： 對(duì)腺樣囊性癌細(xì)胞通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染導(dǎo)入IκBα-M的基因,將轉(zhuǎn)染后的ACC-2細(xì)胞進(jìn)行6種劑量(0、2、4、6、8、10Gy)的高能X線照射,在照射后不同時(shí)間點(diǎn)(1、3、6、10、24、48h)應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)ACC-2細(xì)胞NF-κB p65的核內(nèi)移位情況,應(yīng)用Western blot技術(shù)定量檢測(cè)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)NF-κB p65的蛋白表達(dá)情況,同時(shí)采用流式細(xì)胞術(shù)和原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling assay, TUNEL)檢測(cè)相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞的凋亡情況,探討NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在放射線誘導(dǎo)的人唾液腺腺樣囊性癌ACC-2細(xì)胞凋亡中的變化規(guī)律。為進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用提供細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 實(shí)驗(yàn)方法： 實(shí)驗(yàn)采用腺樣囊性癌ACC-2細(xì)胞系,于37℃恒溫下于5%CO2、飽和濕度的孵箱中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),傳代細(xì)胞。待細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后,采用脂質(zhì)體2000將pBabe-SR-IκBa質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入ACC-2細(xì)胞,Western blot法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后IκBa蛋白表達(dá)的變化,將轉(zhuǎn)染后的ACC-2細(xì)胞進(jìn)行6種劑量(0、2、4、6、8、10Gy)的高能X線照射,在照射后不同時(shí)間點(diǎn)(1、3、6、10、24、48h)應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)ACC-2細(xì)胞NF-κB p65的表達(dá)情況,應(yīng)用Image Pro-Plus圖像分析軟件測(cè)其細(xì)胞核平均灰度值,應(yīng)用Western blot技術(shù)定量分析NF-κB p65蛋白表達(dá)的變化。并同時(shí)應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)(Flow cytometric analysis)和原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling assay, TUNEL)檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)和劑量組的細(xì)胞凋亡率。以上各實(shí)驗(yàn)步驟統(tǒng)一細(xì)胞生長(zhǎng)的外環(huán)境,并設(shè)置轉(zhuǎn)染pBabe空白質(zhì)粒組和未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組,關(guān)鍵步驟重復(fù)兩遍以減少系統(tǒng)誤差,并用SPSS16.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行檢驗(yàn)分析。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1.與轉(zhuǎn)染pBabe空白質(zhì)粒組和未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組比較,轉(zhuǎn)染pBabe-SR-IκBa質(zhì)粒ACC-2細(xì)胞不僅表達(dá)內(nèi)源性IKBa,同時(shí)也表達(dá)SR-IκBa;接受相同放射線劑量照射后3h細(xì)胞核平均灰度值升高(P0.05)。 2. SR-IκBa質(zhì)粒組中,免疫組化實(shí)驗(yàn)顯示不同劑量組的細(xì)胞核平均灰度值均低于0Gy組,Western blot技術(shù)顯示各個(gè)劑量組的p65蛋白表達(dá)均高于0Gy組。與此相對(duì)應(yīng)的是,流式細(xì)胞術(shù)(Flow cytometric analysis)和原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)顯示細(xì)胞接受各個(gè)劑量放射治療后的細(xì)胞凋亡率均高于未接受放療的0Gy組。 3.免疫組化實(shí)驗(yàn)和Western blot技術(shù)顯示,約在接受照射后6-10h,細(xì)胞核平均灰度值達(dá)到最低值,此時(shí)細(xì)胞內(nèi)NF-κB p65蛋白的表達(dá)量達(dá)到峰值；相同時(shí)間點(diǎn)上,3h組細(xì)胞細(xì)胞核平均灰度值隨放射劑量增加而降低,細(xì)胞內(nèi)NF-κB p65蛋白的表達(dá)量也隨著放射劑量的增大而增加(P0.05)。 4.流式細(xì)胞術(shù)(Flow cytometric analysis)和原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)顯示轉(zhuǎn)染目的基因后,接受放療的細(xì)胞的凋亡率隨NF-κB p65蛋白的表達(dá)量增加而表現(xiàn)為相反的趨勢(shì),即照射后6-10h細(xì)胞的凋亡率達(dá)到最低值,3h組細(xì)胞的凋亡率隨照射劑量的增加而降低。 研究結(jié)論： 轉(zhuǎn)染突變的IκBa基因可特異性抑制NF-κB信號(hào)通路,經(jīng)放射線照射誘導(dǎo)凋亡后,NF-κB p65蛋白的表達(dá)量具有一定的時(shí)間—?jiǎng)┝啃?yīng)規(guī)律,p65蛋白的表達(dá)可抑制ACC-2細(xì)胞的凋亡。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R739.8

【參考文獻(xiàn)】

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1 王慶端,宋玉成,江金花,夏薇;NF-κB與腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性[J];河南腫瘤學(xué)雜志;2005年01期

本文編號(hào)：2772858