【摘要】：研究背景牙髓干細(xì)胞是一群存在于牙髓組織中間充質(zhì)來源的成體干細(xì)胞,具有高增殖活性、自我更新能力及多向分化潛能。在牙髓損傷修復(fù)過程中,可以分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等功能細(xì)胞,維持局部組織的穩(wěn)態(tài)平衡,在牙髓組織的損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用。然而,隨著年齡的增長,組織干細(xì)胞的再生潛能下降。這可能與干細(xì)胞數(shù)目的減少、固有功能減弱及干細(xì)胞所處的微環(huán)境改變相關(guān)。當(dāng)牙髓組織暴露于細(xì)菌的代謝產(chǎn)物時(shí),可產(chǎn)生不同程度的炎癥反應(yīng)。炎癥反應(yīng)輕微時(shí),牙髓干細(xì)胞可分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞,參與牙髓組織修復(fù)過程,炎癥劇烈時(shí)可引起牙髓組織壞死。供體年齡作為影響細(xì)胞生存微環(huán)境的重要因素之一,對牙髓干細(xì)胞的增殖和分化具有一定的影響。然而,關(guān)于不同年齡供體來源的牙髓干細(xì)胞對炎癥刺激的反應(yīng)及修復(fù)的能力的差異目前相關(guān)報(bào)道甚少。故本實(shí)驗(yàn)擬采用細(xì)菌脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)刺激牙髓干細(xì)胞體外模擬炎癥微環(huán)境,探究不同鼠齡牙髓干細(xì)胞在炎癥狀態(tài)下增殖及礦化等相關(guān)特性的差異,進(jìn)一步探究年齡因素對牙髓干細(xì)胞受炎癥刺激后修復(fù)再生能力的影響,為牙髓干細(xì)胞在牙髓損傷修復(fù)中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。材料與方法1.幼齡大鼠牙髓干細(xì)胞及成齡大鼠牙髓干細(xì)胞分離培養(yǎng)及鑒定采用改良組織塊酶消化法從幼齡Sprague-Dawley大鼠及成齡Sprague-Dawley大鼠牙髓組織中分離純化出牙髓干細(xì)胞,命名為幼齡鼠牙髓干細(xì)胞(juvenile rat dental pulp stem cells,JDPSCs)與成齡鼠牙髓干細(xì)胞(adult rat dental pulp stem cells,ADPSCs)。進(jìn)行成脂、成骨/成牙本質(zhì)向誘導(dǎo)分化,檢測多向分化潛能;流式細(xì)胞術(shù)檢測相關(guān)細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)。2.大鼠牙髓組織及牙髓干細(xì)胞增齡性變化兩種鼠齡牙髓組織切片HE染色、牙髓干細(xì)胞及組織切片衰老相關(guān)(β-半乳糖苷酶(Senescence p-Galactosidase,SA-P-Gal)染色比較大鼠牙髓組織、牙髓干細(xì)胞增齡性變化;CCK8實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)比較JDPSCs和ADPSCs增殖能力。3.不同濃度LPS對JDPSCs和ADPSCs增殖及礦化的影響采用CCK8實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞術(shù)檢測LPS對JDPSCs和ADPSCs增殖能力的影響。在礦化誘導(dǎo)的條件下,采用茜素紅染色、堿性磷酸酶染色、qRT-PCR及Western Blot等檢測LPS對JDPSCs和ADPSCs成骨/成牙本質(zhì)向分化的影響。結(jié)果1.JDPSCs和ADPSCs的生物學(xué)特性及牙髓組織的增齡性變化本實(shí)驗(yàn)成功從大鼠牙髓組織中分離純化出JDPSCs和ADPSCs,兩種細(xì)胞均可成骨/成牙本質(zhì)向及成脂向分化,陽性表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)分子記物CD90、CD29,陰性表達(dá)造血干細(xì)胞表面分子標(biāo)記物CD45;從刺激的第1d起,在同一時(shí)間點(diǎn)下ADPSCs的增殖OD低于JDPSCs(P0.01),ADPSCs處于S期的細(xì)胞比例顯著低于JDPSCs(P0.01);ADPSCs較JDPSCs有更高的SA-β-Gal表達(dá)水平(P0.01);成齡鼠牙髓組織血管含量及組織SA-β-Gal表達(dá)較幼齡鼠的增多。2.JDPSCs和ADPSCs在LPS刺激下細(xì)胞增殖及礦化的變化CCK8結(jié)果顯示LPS刺激濃度為0.1-1μg/mL時(shí),從刺激的第1d至第5d,在同一時(shí)間點(diǎn),JDPSCs受LPS刺激實(shí)驗(yàn)組較無LPS刺激對照組OD值顯著升高,ADPSCs受LPS刺激實(shí)驗(yàn)組較對照組的OD值高(P0.01),且在LPS刺激下JDPSCs組的增加趨勢明顯大于ADPSCs組;當(dāng)LPS濃度為10 μg/mL或100 μg/mL時(shí),JDPSCs及ADPSCs在刺激的早期(24 h),同一時(shí)間點(diǎn)下,實(shí)驗(yàn)組較無LPS刺激的對照組OD值明顯升高(P0.05),而隨著刺激時(shí)間延長,實(shí)驗(yàn)組的OD值降低。在礦化誘導(dǎo)條件下,低濃度的LPS(1 μg/mL)均能促進(jìn)JDPSCs和ADPSCs礦化結(jié)節(jié)形成,JDPSCs增多趨勢較ADPSCs明顯;RT-PCR及Western Blot結(jié)果表明低濃度LPS促進(jìn)JDPSCs和ADPSCs礦化相關(guān)基因(ALP、OCN、BSP、DSPP)及蛋白(ALP)的表達(dá),且JDPSCs促進(jìn)趨勢明顯高于ADPSCs。結(jié)論1.幼齡及成齡大鼠牙髓組織中可分離培養(yǎng)出牙髓干細(xì)胞,JDPSCs和ADPSCs均為間充質(zhì)來源,具有多向分化潛能。JDPSCs比ADPSCs有較高增殖能力,較低的SA-p-Gal表達(dá)水平。2.低濃度LPS(0.1-1 μg/mL)促進(jìn)JDPSCs及ADPSCs的增殖,并且對JDPSCs促進(jìn)程度明顯大于ADPSCs。較高濃度(10μg/mL或100μg/mL)LPS短時(shí)間(24 h)刺激可促進(jìn)JDPSCs及ADPSCs的增殖,隨著刺激時(shí)間的延長抑制增殖。3.低濃度的LPS(0.5 μg/mL)可以促進(jìn)JDPSCs和ADPSCs礦化相關(guān)基因及蛋白的表達(dá),及礦化結(jié)節(jié)的形成,LPS對JDPSCs成骨/成牙向分化的促進(jìn)作用較ADPSCs明顯,提示JDPSCs較ADPSCs在一定程度的炎癥微環(huán)境中有更強(qiáng)的修復(fù)能力。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R78
【圖文】：

邐頌士學(xué)位論文邐逡逑如圖１－１邋Ｄ，兩種細(xì)胞均為短梭形、多角形，呈放射狀或漩渦狀圍繞在組織塊四逡逑周，兩種細(xì)胞形態(tài)無明顯差異。將第Ｉ代細(xì)胞進(jìn)行有限稀釋法純化培養(yǎng)，培養(yǎng)逡逑的第１４邋ｄ兩種細(xì)胞均能形成集落樣生長如圖１－１邋Ｂ、Ｅ。將幼齡及成齡大鼠牙髓逡逑干細(xì)胞以相同密度傳代，均貼壁良好，幼齡大鼠牙髓干細(xì)胞增殖速度較快，約逡逑６－７邋ｄ細(xì)胞密度達(dá)９５％如圖１－１邋Ｃ，成齡大鼠牙髓干細(xì)胞８－１０邋ｄ細(xì)胞密度達(dá)９５％逡逑如圖１－１邋Ｆ。逡逑

邐第一章幼齡及成齡大鼠牙髓干細(xì)胞分離培養(yǎng)及鑒定邐逡逑中有大小不一的深紅色礦化結(jié)節(jié)形成如圖１－２Ａ、Ｃ。逡逑２．２．２邋ＪＤＰＳＣｓ與ＡＤＰＳＣｓ的成脂向誘導(dǎo)分化逡逑幼齡及成齡大鼠牙髓干細(xì)胞成脂向分化誘導(dǎo)７邋ｄ后，倒置顯微鏡下觀察，細(xì)逡逑胞密集生長，細(xì)胞成多角形，在細(xì)胞內(nèi)可見透明小脂滴形成。將兩種細(xì)胞固定逡逑后，行油紅０染色，鏡下均可見細(xì)胞內(nèi)有橘紅色脂滴形成（圖１－２邋Ｂ、Ｄ）。逡逑

３討論逡逑本研[偛捎酶牧甲櫓槊趕ǔ曬Υ佑琢洌ǎ粗芰洌┘俺閃洌ǎ對鋁洌┐棋義閑裕櫻拇笫笱浪枳櫓蟹擲肱嘌鲅浪柘赴�，进一步通过有蠈馈暑^ǚ擲氪炕鰣義涎浪韙上赴Ｄ殼骯賾諮浪韙上赴姆擲肱嘌際跫航銜墑歟Ｓ玫姆擲肱噱義涎椒ㄖ饕ㄗ櫓櫸�、泌sㄒ約案牧甲櫓槊趕ǎ常罰薄９諮д卟懾義嫌妹趕ù喲笫笱浪枳櫓擲肱嘌笫笱浪韙上赴�，并证皿x渚哂薪锨康腦鰣義現(xiàn)臣俺裳辣局剩曬竅蚍只芰Γ常福�。辶x媳狙芯吭誶捌謔笛樘剿髦脅捎米櫓櫸ㄅ嘌浪韙上赴�，观矓探幼龄大屎j義涎浪枳櫓樵諤諍蟮模罰保板澹銺嚿伲拖赴ǔ觶持蘢笥以赴拍芙惺狀五義洗閃浯笫笙赴幼櫓榕萊鍪奔涓�，硶瘭率更低。该方法虽然操作辶x喜街柘嘍約虻�，但培养细胞硶瘭聦�(shí)�、周普C�，膸r暈笮笛樘峁┫赴С幀ｅ義險(xiǎn)飪贍蓯怯捎諼淳趕淖櫓渲氏宋煞侄嗲抑旅蘢璋赴ǔ觶⑶業(yè)卞義

本文編號：2750344