【摘要】：研究背景和目的 繼口腔病灶學(xué)說(shuō)之后,近十余年來(lái)研究者們運(yùn)用分子生物學(xué)、基因?qū)W及蛋白組學(xué)等方法深入探討牙周感染和系統(tǒng)性疾病或異常狀況之間存在的內(nèi)在聯(lián)系及相應(yīng)機(jī)制,大量研究結(jié)果表明,牙周感染可能是某些重要的系統(tǒng)性疾病或異常狀況的一個(gè)重要潛在危險(xiǎn)因素,包括心血管疾病(動(dòng)脈粥樣硬化心肌梗死、及腦中風(fēng)等),早產(chǎn)及低體重新生兒,糖尿病,呼吸道感染等。1996年美國(guó)北卡羅來(lái)納大學(xué)Offenbacher教授據(jù)此提出了牙周病學(xué)中的一個(gè)新的分支學(xué)科,即為牙周醫(yī)學(xué)(Periodontal medicine),以揭示牙周健康或疾病與全身健康和疾病之間的雙向聯(lián)系及其意義。 牙周炎低度炎癥狀態(tài)可以增加全身的炎癥負(fù)荷,這可能是因?yàn)槁匝乐苎资羌?xì)菌引起牙周組織的慢性感染,在細(xì)菌及其毒性產(chǎn)物的作用下,造成牙周組織破壞,牙周袋內(nèi)形成潰瘍。重度的牙周炎牙周袋內(nèi)的潰瘍面積可達(dá)72cm2,相當(dāng)于成人手掌大小,研究表明,這些牙周感染可通過(guò)三種不同的機(jī)制影響遠(yuǎn)隔器官或部位：1、細(xì)菌本身通過(guò)入血或淋巴等的遷移性感染,如拔牙、牙周治療、咀嚼等均可引起短暫的菌血癥(Bacteremia),在炎癥的作用下引起血管通透性增加,因此刷牙、口腔治療、甚至咀嚼硬物時(shí)很容易引起牙周致病菌及其毒素入血,形成一過(guò)性的菌血癥引起并加重全身炎癥反應(yīng)；2、細(xì)菌的毒性產(chǎn)物直接引起的損傷,牙周致病菌及其毒性產(chǎn)物還可以刺激牙周組織局部表達(dá)IL-6、TNF-α、PEG2等,這些炎癥介質(zhì)釋放入血后進(jìn)一步加重全身反應(yīng),使血清CRP水平升高；3、細(xì)菌感染引起的免疫損傷。 胰島素抵抗是導(dǎo)致Ⅱ型糖尿病和心血管疾病的主要危險(xiǎn)因素,而肥胖又是胰島素抵抗發(fā)生、發(fā)展的重要危險(xiǎn)因素。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和生活水平的提高肥胖已經(jīng)成為一種世界性流行病,脂肪組織增多和脂肪組織異常分布是導(dǎo)致胰島素抵抗的重要原因。目前,普遍認(rèn)為炎癥是肥胖、胰島素抵抗、糖尿病、等影響全身健康狀態(tài)的發(fā)病機(jī)制之一,牙周炎和肥胖均為人群中最為廣泛存在的疾病,因?yàn)楣餐乃拗餮装Y背景而發(fā)生關(guān)聯(lián),因此成為近年來(lái)牙周醫(yī)學(xué)研究中的一個(gè)熱點(diǎn)。此前已有很多研究表明,牙周炎與肥胖、甘油三酯增高、高密度脂蛋白降低、高血壓、高血糖之間存在不同程度的雙向關(guān)聯(lián)。但是關(guān)于牙周炎在預(yù)防糖尿病發(fā)生中的作用研究較少。在肥胖/胰島素抵抗早期牙周炎是否促進(jìn)這些疾病的向糖尿病或心血管疾病發(fā)生發(fā)展?這些問(wèn)題都尚未可知,因此,本實(shí)驗(yàn)建立肥胖動(dòng)物模型探討牙周炎影響肥胖大鼠胰島素抵抗發(fā)展的可能機(jī)制。從以下幾個(gè)方面進(jìn)行研究：1、分別建立肥胖、牙周炎及肥胖復(fù)合牙周炎大鼠模型。2、牙周炎對(duì)肥胖大鼠胰島形態(tài)和功能的影響。3、炎癥因子在牙周炎促進(jìn)肥胖大鼠胰島素抵抗中的作用。 第一章牙周炎、肥胖及牙周炎復(fù)合肥胖大鼠模型建立 目的 分別建立肥胖、牙周炎及肥胖復(fù)合牙周炎大鼠模型。 方法 (1)建模：新生SD大鼠,將同窩的雄性幼鼠隨機(jī)分為四組：A組(正常對(duì)照組)：不施加任何干預(yù)措施；B組(牙周炎組)：待12周齡,肥胖模型成模同期給予牙周炎干預(yù),腹腔注射10%水合氯醛(0.3ml/100g·bw)麻醉,取仰臥位,大鼠四肢與頭固定于手術(shù)架上,將大鼠舌牽出絲線捆綁固定,以防止窒息。將3.0絲線分別結(jié)扎于左、右上頜第一磨牙(molar2, M2)及第二磨習(xí)(molar1, M1)牙頸部并盡量置于齦溝內(nèi),將濃度為109CFU/ml的4種標(biāo)準(zhǔn)菌混合懸液接種于齦溝內(nèi),每周檢查絲線一次,有脫落者及時(shí)重新結(jié)扎。建模時(shí)間為8周；C組(肥胖組)：于出生后第1天至第10天隔天在皮下注射谷氨酸鈉溶液(Sigma)(3mg/kg·bw);建模時(shí)間為12周；D組(復(fù)合組)：肥胖建模處理同C組,12周時(shí)肥胖成模后給予與B組相同的處理。建模時(shí)間為20周。所有大鼠21天哺乳期后均以常規(guī)鼠飼料喂飼,自由飲食水； (2)牙周炎模型檢測(cè)：外觀觀察牙齦組織炎癥變化,組織學(xué)檢測(cè)及Micro CT掃描計(jì)算骨喪失水平,以上方法判斷牙周炎模型。 (3)肥胖模型檢測(cè)：測(cè)量體質(zhì)量、體長(zhǎng)、計(jì)算肥胖指數(shù),檢測(cè)血清血脂及血清空腹葡萄糖、空腹胰島素,計(jì)算穩(wěn)態(tài)模型下的胰島素抵抗指數(shù)等,以上方法判斷肥胖大鼠模型。 (4)牙周炎復(fù)合肥胖模型檢測(cè)：綜合牙周炎模型診斷及肥胖模型診斷方法判斷肥胖復(fù)合牙周炎大鼠模型建立。 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示。應(yīng)用SPSS v13.0軟件(SPSS Inc., Chicago, USA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各指標(biāo)先進(jìn)行正態(tài)性及Levene's test方差齊性檢驗(yàn)。兩因素兩水平數(shù)據(jù)比較采用2×2析因設(shè)計(jì),分析兩種干預(yù)交互作用、單獨(dú)效應(yīng)及主效應(yīng),采用t檢驗(yàn)進(jìn)行單獨(dú)效應(yīng)分析。當(dāng)P0.05時(shí),被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果 (1)肥胖模型檢測(cè)：大鼠12周齡時(shí),與正常對(duì)照組相比,MSG誘導(dǎo)組體重增加,Lee's指數(shù)升高。血清指標(biāo)結(jié)果顯示,注射MSG的肥胖組大鼠有明顯血糖,胰島素升高及胰島素抵抗。這些指標(biāo)具有MSG誘導(dǎo)的肥胖及胰島素抵抗模型特征。肝臟組織切片,HE染色后可見(jiàn)肥胖組大鼠肝臟內(nèi)有脂肪異位沉積,肝細(xì)胞內(nèi)有空泡狀脂滴,肝細(xì)胞內(nèi)有混合性大小泡性脂變是肥胖及其引起胰島素抵抗在肝臟的典型表現(xiàn)。胰腺的組織學(xué)切片,HE染色后觀察肥胖組胰腺外分泌腺萎縮,脂肪細(xì)胞異位沉積并取代外分泌腺泡細(xì)胞。 (2)牙周炎模型檢測(cè)：牙周檢查發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)牙牙頸部結(jié)扎處有食物殘留,去除絲線后可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)牙牙齦呈暗紅色,向冠方腫脹或發(fā)生退縮,齦乳頭和齦緣水腫,質(zhì)地松軟,部分牙齒松動(dòng),部分牙根暴露。HE染色牙周炎組牙周組織牙周膜間隙增寬,牙周膜中纖維排列紊亂,上皮釘突增生,血管擴(kuò)張,牙周膜中有形成份減少,大鼠牙齦結(jié)合上皮向根方增殖,形成明顯牙周袋,溝內(nèi)上皮出現(xiàn)糜爛,呈網(wǎng)眼狀,纖維結(jié)締組織水腫明顯,可見(jiàn)少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。三維重建圖像顯示,與正常對(duì)照組相比較牙周炎組兩顆實(shí)驗(yàn)牙相鄰面及頰舌面均有明顯的骨高度下降,實(shí)驗(yàn)牙牙根面部分暴露。計(jì)算結(jié)果顯示正常對(duì)照組骨吸收量與肥胖組相似,無(wú)顯著差異。牙周炎組有大量骨喪失,與前兩組相比較有顯著差異。說(shuō)明牙周炎干預(yù)成功,造成明顯骨吸收。 (3)肥胖復(fù)合牙周炎模型檢測(cè)：肥胖復(fù)合牙周炎的大鼠具有明顯的肥胖,血清葡萄糖及胰島素也升高且有明顯的胰島素抵抗,這都符合肥胖伴胰島素抵抗動(dòng)物模型的特征。同時(shí),也具有明顯的牙周炎癥：牙周軟組織破壞及骨組織吸收,骨高度降低,骨量減少。 結(jié)論 采用新生小鼠皮下注射谷氨酸鈉及牙周局部絲線結(jié)扎合并涂菌的方法成功建立了肥胖復(fù)合牙周炎的大鼠模型。 第二章牙周炎對(duì)肥胖大鼠胰島形態(tài)和功能的影響 目的 觀察和檢測(cè)牙周炎復(fù)合肥胖大鼠胰島的形態(tài)和功能改變。 方法 免疫組化染色采用自動(dòng)顯微鏡,Image-Pro Plus6.0拍攝系統(tǒng),由不知實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及分組情況的病理醫(yī)師讀片,結(jié)果判定：胰島素、Caspase-3及IRS-2陽(yáng)性染色為褐棕色顆粒,定位于細(xì)胞質(zhì)。各實(shí)驗(yàn)組分別與PBS代替一抗空白對(duì)照進(jìn)行對(duì)比觀察,并進(jìn)行圖像采集。 網(wǎng)格計(jì)數(shù)法計(jì)算胰島p細(xì)胞相對(duì)量：平分胰腺不同的6個(gè)層次獲得共18張切片／只大鼠,每張切片取10-15個(gè)視野。采集胰島素免疫組化染色照片,用15×15條線將200倍鏡下所采集的圖片分割為方格得出225個(gè)交叉點(diǎn),用Image J軟件計(jì)算位于交叉點(diǎn)的包漿胰島素陽(yáng)性的細(xì)胞核數(shù)量除以交叉點(diǎn)數(shù)量以該比例記為該視野下的p細(xì)胞相對(duì)量。用總計(jì)p細(xì)胞相對(duì)量乘以胰腺的重量得出β細(xì)胞量(β-cell mass)。 光密度值計(jì)算：取每組8只大鼠胰島組織切片,在胰腺胰尾處胰島較集中的位置從不同的3個(gè)層次獲得共12張切片/只大鼠,分別進(jìn)行胰島素受體底物-2(IRS-2)染色及細(xì)胞凋亡蛋白酶-3(Caspase-3)免疫組化染色,在200倍光鏡下,采用Image-Pro Plus6.0圖像系統(tǒng)采集所有胰島數(shù)碼照片,每只大鼠計(jì)算至少50個(gè)胰島。打開(kāi)Image-Pro Plus6.0圖像分析系統(tǒng),首先對(duì)圖片進(jìn)行光密度校正,選取測(cè)量區(qū)域,然后選取測(cè)量項(xiàng)目綜合光密度(Integrated optical density, IOD)及測(cè)量面積,輸出數(shù)據(jù),統(tǒng)計(jì)上述區(qū)域的平均IOD值,最后取均值作為代表每組切片染色強(qiáng)度的IOD值。 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示。應(yīng)用SPSS v13.0軟件(SPSS Inc., Chicago, USA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各指標(biāo)先進(jìn)行正態(tài)性及Levene's test方差齊性檢驗(yàn)。兩因素兩水平數(shù)據(jù)比較采用2×2析因設(shè)計(jì),分析兩種干預(yù)交互作用、單獨(dú)效應(yīng)及主效應(yīng),采用t檢驗(yàn)進(jìn)行單獨(dú)效應(yīng)分析。相關(guān)分析采用Pearson目關(guān)。當(dāng)P0.05時(shí),被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果 (1)HE染色光鏡下觀察四組大鼠胰島形態(tài)：正常胰島被薄層結(jié)締組織包裹,與外分泌腺界限清晰,以β細(xì)胞為核心α細(xì)胞位于胰島外層。肥胖組胰腺外分泌腺萎縮,脂肪細(xì)胞異位沉積并取代外分泌腺泡細(xì)胞,胰島內(nèi)未見(jiàn)纖維化改變。牙周炎復(fù)合肥胖組,胰島邊界不規(guī)則,胰島內(nèi)明顯纖維化,外分泌腺伸入胰島內(nèi),α細(xì)胞、β細(xì)胞排列紊亂。 (2)檢測(cè)復(fù)合組與單純肥胖p細(xì)胞量的差異,探討兩組大鼠p細(xì)胞的代償能力。胰島p細(xì)胞形態(tài)學(xué)測(cè)量結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組相比,單純肥胖組p細(xì)胞量增加。單純肥胖組與復(fù)合組比較,后者β細(xì)胞量顯著減少。復(fù)合組大鼠胰島病理改變的同時(shí)p細(xì)胞量減少,提示牙周炎促進(jìn)了p細(xì)胞代償機(jī)制的衰退。進(jìn)一步對(duì)胰島β細(xì)胞凋亡情況的檢測(cè)顯示,Caspase-3在復(fù)合組的表達(dá)顯著高于單純肥胖組,交互作用分析胰島Caspase-3蛋白表達(dá),結(jié)果顯示,牙周炎處理與肥胖處理存在交互作用,提示牙周炎促進(jìn)了肥胖大鼠胰島內(nèi)Caspase-3表達(dá)上調(diào)。 (3)檢測(cè)胰島內(nèi)IRS-2蛋白相對(duì)量表達(dá),初步分析牙周炎影響肥胖大鼠p細(xì)胞代償功能可能的途徑,結(jié)果顯示,肥胖組表達(dá)顯著高于復(fù)合組。IRS-2結(jié)果的析因分析顯示,牙周炎處理與肥胖處理存在交互作用,提示在復(fù)合組IRS-2表達(dá)的下降與牙周炎干預(yù)有關(guān)。IRS-2蛋白相對(duì)量與β細(xì)胞量相關(guān)性分析顯示為正相關(guān),IRS-2蛋白量減少時(shí)p細(xì)胞量也隨之減少。提示p細(xì)胞量減少與IRS-2表達(dá)下調(diào)有關(guān)。 結(jié)論 (1)肥胖狀態(tài)下,牙周炎可以促使胰島p細(xì)胞量減少,p細(xì)胞功能受損。 (2)牙周炎可能通過(guò)上調(diào)p細(xì)胞Caspase-3表達(dá)途徑及下調(diào)胰島素受體底物-2途徑,影響肥胖大鼠β細(xì)胞量及功能。 第三章牙周炎合并肥胖大鼠血清炎癥因子水平升高及其促胰島素抵抗作用 目的 本實(shí)驗(yàn)討論牙周炎對(duì)肥胖大鼠血清中TNF-α、CRP及IL-1β表達(dá)與相關(guān)組織器官病變之間的關(guān)系,試探討牙周炎可能通過(guò)這些炎癥因子對(duì)肥胖大鼠產(chǎn)生的促胰島素抵抗作用。 方法 (1)ELISA方法檢測(cè)血清TNF-α、CRP及IL-1β表達(dá),分析及其胰島素抵抗的相關(guān)性。 (2)取每組8只大鼠,牙周組織近遠(yuǎn)中向切片4張/只大鼠,分別進(jìn)行TNF-a及IL-1β免疫組化染色。采用自動(dòng)顯微鏡,Image-Pro Plus6.0拍攝系統(tǒng),由不知實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及分組情況的病理醫(yī)師讀片,結(jié)果判定：TNF-α及IL-1β陽(yáng)性染色為褐棕色顆粒,定位于細(xì)胞質(zhì)。TNF-a常見(jiàn)于成纖維細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、炎癥細(xì)胞。IL-1p常見(jiàn)于成纖維細(xì)胞及炎癥細(xì)胞。各實(shí)驗(yàn)組分別與PBS代替一抗空白對(duì)照進(jìn)行對(duì)比觀察,并進(jìn)行圖像采集及光密度值計(jì)算。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示。應(yīng)用SPSS v13.0軟件(SPSS Inc., Chicago, USA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各指標(biāo)先進(jìn)行正態(tài)性及Levene's test方差齊性檢驗(yàn)。兩因素兩水平數(shù)據(jù)比較采用2×2析因設(shè)計(jì),分析兩種干預(yù)交互作用、單獨(dú)效應(yīng)及主效應(yīng),采用t檢驗(yàn)進(jìn)行單獨(dú)效應(yīng)分析。相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)。當(dāng)P0.05時(shí),被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果 (1)各組牙周組織TNF-α及IL-1p免疫組化染色,在牙周炎組及復(fù)合組成纖維細(xì)胞、上皮內(nèi)纖維化組織及少量角化上皮內(nèi)見(jiàn)棕色顆粒TNF-a及IL-1β陽(yáng)性表達(dá)。平均光密度值計(jì)算結(jié)果顯示,有牙周炎干預(yù)的實(shí)驗(yàn)大鼠牙周組織TNF-α及IL-1p相對(duì)蛋白量顯著高于其余兩組。而肥胖大鼠牙周局部未檢測(cè)到TNF-α及IL-1p表達(dá)升高。析因分析TNF-α及IL-1p在牙周局部的表達(dá),結(jié)果顯示,肥胖處理與牙周炎處理之間無(wú)交互作用,提示肥胖未對(duì)局部正常及炎癥時(shí)的牙周組織產(chǎn)生促TNF-α及IL-1β表達(dá)的作用。 (2)血清ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示,復(fù)合組TNF-α、 CRP及IL-1β水平均顯著高于其余各組,以上各指標(biāo)的交互作用分析結(jié)果提示,肥胖狀態(tài)下,牙周炎上調(diào)了大鼠血清中TNF-α、CRP及IL-1β水平。相關(guān)性分析顯示,TNF-α、CRP及IL-1β均與胰島素抵抗呈正相關(guān)性。 結(jié)論 (1)大鼠牙周炎時(shí),局部TNF-α及IL-1p表達(dá)增加。肥胖對(duì)于正常及炎癥時(shí)的牙周局部TNF-α及IL-1β表達(dá)均未見(jiàn)明顯促進(jìn)作用。 (2)肥胖復(fù)合牙周炎大鼠胰島素抵抗加重可能與其血清TNF-α、CRP及IL-1β水平增高有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類(lèi)號(hào)】：R781.42;R589.2

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前5條

1 朱建華;遲玉紅;張艷秋;劉繼光;;去卵巢牙周炎模型大鼠牙槽骨吸收與補(bǔ)骨脂的干預(yù)[J];中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù);2011年41期

2 劉率男;劉泉;申竹芳;;代謝綜合征MSG肥胖大鼠胰島β細(xì)胞功能紊亂機(jī)制的初步研究[J];藥學(xué)學(xué)報(bào);2008年11期

3 史鳳芹，于世鳳，龐淑珍;牙周炎動(dòng)物模型初步研究[J];中華口腔醫(yī)學(xué)雜志;1994年01期

4 孟煥新,謝昊,陳智濱,王洪君,章魁華,曹采方;小型豬實(shí)驗(yàn)性牙周炎的觀察[J];中華口腔醫(yī)學(xué)雜志;1996年06期

5 張?jiān)疵?倪佳;徐雋;鐘良軍;楊文圣;周曉歡;;白細(xì)胞介素-6在大鼠慢性牙周炎合并動(dòng)脈粥樣硬化模型中的表達(dá)[J];中華口腔醫(yī)學(xué)研究雜志(電子版);2009年03期

本文編號(hào)：2747315