【摘要】：研究背景： 口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)是最常見的十大惡性腫瘤之一,而在我國口腔鱗狀細(xì)胞癌中,舌鱗癌(tongue squamous cell carcinoma, TSCC)的發(fā)病率居第一位。舌癌生長快,侵襲性較強(qiáng),易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,預(yù)后相對(duì)較差。其治療方法常是手術(shù)、放療、化療等的綜合治療,但患者的五年生存率仍然很低,因此尋找積極有效的預(yù)防途徑及有效的治療藥物顯得尤為迫切和必要。 硫氧還蛋白系統(tǒng)是生物體內(nèi)主要的抗氧化系統(tǒng)之一,由硫氧還蛋白(Thioredoxin, Trx)、硫氧還蛋白還原酶(Thioredoxin reductase, TrxR)和NADPH三部分組成,是一個(gè)廣泛分布的NADPH依賴性二硫化物還原酶系統(tǒng)。Trx通過直接清除過氧化氫以及還原某些特異性酶而發(fā)揮其抗氧化作用,而TrxR是唯一可以還原Trx的還原劑。學(xué)者證實(shí),Trx與TrxR在多種腫瘤組織中呈高表達(dá)狀態(tài),且高表達(dá)的Trx與細(xì)胞增殖活性的增高呈正相關(guān)關(guān)系,因此硫氧還蛋白系統(tǒng)在腫瘤細(xì)胞的增殖和分化中起著重要的作用。抑制硫氧還蛋白系統(tǒng)的功能可能會(huì)抑制腫瘤細(xì)胞的生長。因此,本研究旨在探討Trx系統(tǒng)蛋白在舌癌中表達(dá)情況,以及其在舌癌發(fā)生發(fā)展中的作用。研究內(nèi)容共分為以下三部分： 第一部分硫氧還蛋白系統(tǒng)蛋白在人舌癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理因素、預(yù)后的關(guān)系 目的檢測硫氧還蛋白(Trx, Thioredoxin)和硫氧還蛋白還原酶(Thioredoxin reductase, TrxR)在人舌鱗癌(tongue squamous cell carcinoma, TSCC)組織中的蛋白表達(dá)水平,及與臨床病理因素、預(yù)后的關(guān)系。材料和方法選取武漢大學(xué)口腔醫(yī)院2003年至2005年經(jīng)手術(shù)切除的舌癌組織共65例作為研究對(duì)象,并以正�？谇火つど掀ぷ鰧�(duì)照。采用免疫組化SP法分別檢測Trx和TrxR-1的表達(dá)水平,應(yīng)用SPSS16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析：采用卡方檢驗(yàn),四格表確切概率法以及相關(guān)性分析等方法檢測Trx和TrxR-1在舌癌組織和正�？谇火つど掀さ谋磉_(dá)差異及相關(guān)性,并對(duì)全部病例進(jìn)行隨訪。結(jié)果Trx與TrxR-1主要表達(dá)在腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì),少數(shù)表達(dá)于細(xì)胞核。65例腫瘤組織中,Trx與TrxR-1的表達(dá)率分別為100%(65／65),95.4%(62／65)；而在10例正�？谇火つぶ�,Trx在9例、TrxR-1在10例中均為低表達(dá)。舌癌組織中Trx與TrxR-1的表達(dá)顯著高于正常對(duì)照(P=0.000,0.000)。在與臨床病理學(xué)因素的比較中發(fā)現(xiàn),Trx與腫瘤分化程度明顯相關(guān)(P=0.001)；而TrxR-1與腫瘤分化程度,性別,年齡,TNM分期,淋巴轉(zhuǎn)移,復(fù)發(fā)等均無顯著相關(guān)性(P0.05)。相關(guān)分析表明,Trx與TrxR-1呈高度正相關(guān)關(guān)系,隨著TrxR-1的表達(dá)增高,Trx也隨之增高(P=0.001)。生存分析發(fā)現(xiàn),Trx低表達(dá)組與Trx中,高度表達(dá)組間存在顯著的差異性,Trx中度及高度表達(dá)的患者預(yù)后較差,生存時(shí)間較短(P=0.033)。結(jié)論舌癌組織中Trx與TrxR-1過表達(dá),并且二者呈顯著相關(guān)性,高表達(dá)的Trx可以預(yù)測舌癌的不良預(yù)后,還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明Trx與TrxR-1在舌癌發(fā)生中的具體作用機(jī)制。 第二部分硫氧還蛋白還原酶抑制劑楊梅黃酮對(duì)人舌癌CAL-27細(xì)胞增殖、凋亡的影響 目的采用體外培養(yǎng)人舌癌CAL-27細(xì)胞的方法,觀察不同濃度的楊梅黃酮對(duì)其生長產(chǎn)生的作用。材料和方法光學(xué)顯微鏡觀察未經(jīng)和經(jīng)楊梅黃酮作用的CAL-27細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化；應(yīng)用透射電鏡觀察經(jīng)120μmol/L楊梅黃酮作用12h的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化；濃度為120μmol/L的楊梅黃酮作用12h后,Hoechst33258熒光染色觀察細(xì)胞形態(tài)；濃度為40、80、120、160、200μmol／L楊梅黃酮作用于CAL-27細(xì)胞,分別培養(yǎng)6,12,24h后,采用MTT比色法,檢測CAL-27細(xì)胞增殖活性的改變,觀察不同濃度楊梅黃酮作用不同時(shí)間后對(duì)人舌癌CAL-27的毒性效應(yīng)；經(jīng)濃度為40、80、120、160、200μmol／L楊梅黃酮作用于CAL-27細(xì)胞12h后,用Annexin V/PI雙染色流式細(xì)胞術(shù)法檢測細(xì)胞凋亡率；采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS16.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,數(shù)據(jù)用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示。結(jié)果經(jīng)楊梅黃酮作用后,CAL-27細(xì)胞的形態(tài)以及超微結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化。透射電鏡及熒光染色觀察到腫瘤細(xì)胞發(fā)生了明顯的形態(tài)學(xué)改變,可見細(xì)胞骨架破壞,染色體固縮,細(xì)胞核碎裂以及凋亡小體形成等。MTT結(jié)果顯示楊梅黃酮對(duì)CAL-27細(xì)胞具有明顯的生長抑制作用,并呈現(xiàn)明顯的濃度和時(shí)間依賴性；不同濃度組間、不同時(shí)間組間生長抑制率均有顯著性差異(P0.05)。200μmol/L楊梅黃酮作用24h后細(xì)胞生長抑制率達(dá)94.21%。流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的凋亡率隨著楊梅黃酮濃度的增高而升高,由(14.60%±2.44%)增加到(62.91%±3.54%),各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論楊梅黃酮對(duì)人舌癌細(xì)胞CAL-27具有明顯的生長抑制及促進(jìn)凋亡作用,并且作用強(qiáng)度隨著楊梅黃酮濃度的升高以及時(shí)間的延長而增強(qiáng)。 第三部分楊梅黃酮促進(jìn)人舌癌CAL-27細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制 目的分別研究在不同時(shí)間、不同濃度的楊梅黃酮作用下,人舌癌細(xì)胞CAL-27中TrxR的活性變化,重點(diǎn)研究Trx下游調(diào)控分子及caspase3在楊梅黃酮促進(jìn)舌癌細(xì)胞凋亡過程中的參與機(jī)制。材料和方法濃度為40、80、120、160、200μmol/L楊梅黃酮作用于CAL-27細(xì)胞,分別培養(yǎng)6、12、24h后,用TrxR活性試劑盒檢測TrxR的活性；濃度為40、80、120、160、200μmol/L楊梅黃酮作用于CAL-27細(xì)胞培養(yǎng)12h后,或濃度為120μmol/L楊梅黃酮作用于腫瘤細(xì)胞分別培養(yǎng)1、3、6及12h后,采用免疫蛋白印記法(Western Blotting)檢測藥物作用后的CAL-27細(xì)胞中p-ASK1, ASK1, p-p38, p38, p-JNK和JNK的蛋白表達(dá)水平,并對(duì)檢測結(jié)果進(jìn)行半定量分析；應(yīng)用caspase3活性檢測試劑盒測定經(jīng)濃度為40、80、120、160、200μmol/L楊梅黃酮分別作用6、12、24h后腫瘤細(xì)胞caspase3的活性；采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS16.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。結(jié)果楊梅黃酮作用后的CAL-27細(xì)胞的TrxR活性被顯著抑制,并具有濃度及時(shí)間依賴性；120μmol/L作用12h,TrxR活性抑制率達(dá)70%以上,200μmol/L作用24h以上,TrxR活性幾乎被完全抑制。Western Blotting檢測結(jié)果顯示經(jīng)楊梅黃酮作用后,CAL-27細(xì)胞的ASKl,p38和JNK表達(dá)減弱,相反p-ASK1, p-p38和p-JNK表達(dá)逐漸升高且具有時(shí)間濃度依賴性。Caspase3活性檢測結(jié)果顯示,經(jīng)楊梅黃酮作用后的CAL-27細(xì)胞caspase3活性增強(qiáng),并呈顯著的濃度及時(shí)間依賴性,結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論楊梅黃酮誘導(dǎo)人舌鱗癌CAL-27細(xì)胞的凋亡作用部分通過調(diào)控TrxR/Trx/ASK1/p38/JNK信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)。
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R739.8

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2747020