發(fā)布時間：2020-07-07 17:25

【摘要】： 目的：骨髓基質細胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)作為間充質細胞，具有多向分化潛能，是一種理想的骨組織工程的種子細胞，有著廣泛的應用前景。隨著細胞生物學及組織工程學研究的深入和發(fā)展，對BMSCs的需求量越來越大，故對其進行長期、大量的保存十分必要。本實驗通過對凍存一年后Beagle犬BMSCs進行復蘇，傳代擴增與誘導分化，探討凍存后BMSCs在體外的成骨潛能，同時，建立實驗動物模型，探討凍存BMSCs與膠原膜構建細胞和支架材料復合體在裸鼠體內的成骨能力，為進一步研究BMSCs修復頜骨缺損、牙周組織缺損的臨床應用提供科學依據(jù)。 方法：本研究分為體外細胞實驗和動物體內實驗兩個部分： 第一部分凍存骨髓基質細胞體外成骨潛能的實驗研究： 選取于液氮中凍存11個月后的成年Beagle犬BMSCs復蘇后進行體外擴增培養(yǎng)，并在實驗組傳代培養(yǎng)中加入10~(-8)mol／L地塞米松、50mg／L維生素C和10mmol／Lβ-甘油磷酸鈉進行誘導分化，對照組未加礦化誘導液，對比觀察細胞生長形態(tài)、細胞誘導前后增殖情況、細胞堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)含量以及形成礦化結節(jié)能力的改變。 第二部分凍存骨髓基質細胞和膠原膜復合材料在裸鼠體內的成骨潛能研究： 體外分離培養(yǎng)Beagle犬BMSCs，凍存二代生長狀況良好的BMSCs。12個月后，復蘇凍存的BMSCs，并在體外構建BMSCs和0.5×0.5cm~2大小的BME-10X復合體。將膠原膜+BMSCs+礦化誘導培養(yǎng)液、膠原膜+BMSCs+基礎培養(yǎng)液、單純膠原膜+礦化誘導培養(yǎng)液培養(yǎng)5天后，植入裸鼠體內，并于術后第4，8，12周取出標本，進行大體觀察和組織病理學分析。 結果：第一部分：凍存BMSCs復蘇后呈成纖維樣表現(xiàn)，增殖力強。體外礦化結節(jié)形成檢測發(fā)現(xiàn)，常規(guī)非誘導培養(yǎng)組細胞于3周左右其中央部分細胞形成細胞團，此細胞團最終形成鈣化結節(jié)。誘導培養(yǎng)組細胞5天后即出現(xiàn)礦化結節(jié)狀。檢測凍存BMSCs增殖情況發(fā)現(xiàn)，復蘇后非誘導BMSCs和誘導BMSCs細胞在1～2天生長緩慢，從第3天起快速增長，于第7天達最高峰。非誘導BMSCs在各個時間點上的A值均高于誘導組；誘導組BMSCs增殖能力降低，生長比較平緩。檢測凍存BMSCs的ALP活性發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時間的延長，非誘導和誘導BMSCs的ALP平均值均增加。4天時兩組無明顯差別，但隨著培養(yǎng)時間延長，誘導組細胞ALP活性增加更為明顯。 第二部分：單純膠原膜+誘導培養(yǎng)液組在植入膠原膜后，膠原膜邊界清晰，膜邊緣及內部基本沒有細胞生長；在膠原膜+BMSCs+基礎培養(yǎng)液組，術后第4周可見，膠原膜內有細胞長入，并有細小的條索狀新生膠原形成，隨著時間的延長，支架膠原逐漸分解，新形成的條索狀膠原纖維變粗大；在膠原膜+BMSCs+礦化誘導培養(yǎng)液組，植入后也可見支架膠原的分解和更多的細胞生長，大量新生的膠原形成類骨質樣組織。 結論：1、凍存BMSCs復蘇傳代后，在體外培養(yǎng)條件下仍保持了較高的細胞存活率、細胞增殖及成骨分化能力，與未礦化誘導相比，經礦化誘導后BMSCs的增殖能力下降，但分化能力增強。 2、凍存BMSCs復蘇后在膠原膜支架材料上生長良好；細胞支架材料復合物移植到裸鼠體內后，隨著時間的延長，支架材料逐漸降解，細胞持續(xù)分泌細胞外基質，類骨質組織逐漸增多。礦化誘導組較非誘導組增加更明顯。 3、凍存BMSCs復蘇后進行培養(yǎng)擴增與誘導分化，不僅在體外培養(yǎng)條件下該細胞仍保持了較高的細胞增殖及成骨分化能力，而且該細胞在體內環(huán)境下復合支架材料，仍具有較強成骨能力，是目前最有希望在臨床廣泛使用的骨組織工程種子細胞。說明凍存可以保持BMSCs的成骨定向分化能力，這為今后大量使用同一來源的凍存種子細胞進行組織工程修復重建研究提供了堅實的理論基礎。
【學位授予單位】：福建醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R78
【圖文】：

圖4BMSCs和誘導BMSCs增殖生長曲線2.5凍存BMScs的ALP活性檢測ALP檢測結果發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時間的延和誘導毗SCs的ALPA值(含量)均增加。4d時2組無明顯差別，但誘導的A值明顯高于非誘導組(只0.05)。隨著誘導時間延長，ALP活性增(表1)。表1BMSCs和誘導BMSCs的ALP活性的比較U/Lt(細胞培養(yǎng)時間)/dMSCs分組—4710非誘導組誘導組5.81士2.9510.11士3.5510.95士2.6816.90士1.99*15.11士425.87士3B毗Cs:骨髓基質細胞;ALP:堿性磷酸酶。

【參考文獻】

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本文編號：2745395