miRNA-1-3p及LAMP2、LC3在成釉細(xì)胞瘤中的表達(dá)及意義

發(fā)布時間：2020-07-07 06:37

【摘要】：目的:成釉細(xì)胞瘤(ameloblastoma,AB)是常見的牙源性上皮源性腫瘤,具有局部侵襲性生長的生物學(xué)特性,且細(xì)胞增殖活躍,術(shù)后易復(fù)發(fā),有惡變可能,甚至可發(fā)生轉(zhuǎn)移,嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量。細(xì)胞自噬是真核細(xì)胞處理自身產(chǎn)生的衰老、損傷或變性的蛋白及細(xì)胞器等生物大分子的一種現(xiàn)象,能使這些來源于細(xì)胞自身的成分在溶酶體內(nèi)降解或再利用,為細(xì)胞提供能量,以幫助其度過生存危機(jī),可起到阻止細(xì)胞衰老和死亡的作用,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮一定作用。溶酶體在自噬過程中發(fā)揮重要作用。溶酶體相關(guān)膜蛋白2(lysosomal associated membrane protein 2,LAMP2)編碼的蛋白是膜糖蛋白家族的成員、溶酶體膜蛋白的主要成分,其具有保護(hù)溶酶體膜免受酸性水解酶水解的功能,在細(xì)胞自噬中也行使一定功能。B細(xì)胞淋巴瘤蛋白質(zhì)2-相互作用蛋白質(zhì)1(B-cell lymphoma-2-interacting protein-1,Beclin1)編碼調(diào)節(jié)自噬的關(guān)鍵蛋白,編碼的蛋白質(zhì)是磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)復(fù)合物的組分,其介導(dǎo)自噬過程中囊泡的運(yùn)輸,是細(xì)胞自噬的啟動基因。在自噬體形成過程中,微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)分子由LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)化為LC3-Ⅱ,LC3-Ⅱ可與新形成的自噬體膜結(jié)合,直至自噬體與溶酶體融合,因此LC3-Ⅱ常被作為細(xì)胞內(nèi)自噬的標(biāo)記物。檢測AB中LAMP2、Beclin1及LC3的表達(dá)水平可反映腫瘤自噬水平。目前,微小RNA(microRNA,miRNA)在轉(zhuǎn)錄后對基因表達(dá)的調(diào)控已受到廣泛關(guān)注,許多研究已證明miRNA在自噬發(fā)生的不同階段可發(fā)揮調(diào)控作用。利用芯片分析及生物信息學(xué)預(yù)測方法,篩選出AB組織中差異表達(dá)的miRNA-1-3p,作為LAMP2的可能調(diào)控分子,進(jìn)一步驗證其表達(dá)與LAMP2表達(dá)的相關(guān)性,從非編碼RNA調(diào)控的角度,為AB的診斷和治療提供新的方向。研究方法:(1)應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色實驗方法,在104例AB組織蠟塊和20例瘤旁正�？谇火つ�(NOM)組織蠟塊中檢測Beclin1、LC3及LAMP2的表達(dá)水平,應(yīng)用Image J軟件對結(jié)果進(jìn)行定量。(2)應(yīng)用蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot,WB)方法在新鮮AB及NOM組織中檢測Beclin1、LC3及LAMP2的表達(dá),以反映AB的自噬水平。(3)結(jié)合課題組前期對AB及NOM中Human miRNA表達(dá)譜芯片檢測的結(jié)果,篩選與AB相關(guān)的差異性表達(dá)的miRNA,在下調(diào)的miRNA中通過生物信息學(xué)分析,選擇miRNA-1-3p作為研究對象。(4)采用實時熒光定量PCR(quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)檢測LAMP2及miRNA-1-3p在12對AB及NOM組織、人永生化成釉細(xì)胞瘤細(xì)胞AM-1及人永生化表皮細(xì)胞Hacat中的表達(dá)。(5)應(yīng)用Spearman相關(guān)分析研究AB組織中miRNA-1-3p與LAMP2表達(dá)水平的相關(guān)性。結(jié)果:(1)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,Beclin1定位于AB上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核,其在AB中表達(dá)的陽性率及定量結(jié)果均低于NOM(P0.05),在性別、年齡、發(fā)病部位、病理分型及是否復(fù)發(fā)方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);LC3定位于AB上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì),其在AB中表達(dá)的陽性率及定量檢測結(jié)果均高于NOM(P0.05),在發(fā)生于下頜骨的AB中LC3表達(dá)的陽性率顯著高于發(fā)生于上頜骨及牙齦者(P0.05),在實性/多囊型AB中LC3表達(dá)的陽性率顯著高于其他三型(P0.05),而在性別、年齡及是否復(fù)發(fā)方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);LAMP2定位于AB上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜,其在AB中表達(dá)的陽性率及定量檢測結(jié)果均高于NOM(P0.05),在發(fā)生于下頜骨的AB中LAMP2表達(dá)的陽性率顯著高于發(fā)生于上頜骨及牙齦者(P0.05),而在性別、年齡、病理分型及是否復(fù)發(fā)方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。(2)WB結(jié)果顯示,AB與NOM相比,Beclin1的表達(dá)水平較低,而LC3、LAMP2的表達(dá)水平較高(P0.05)。(3)結(jié)合課題組前期對AB及NOM中Human miRNA表達(dá)譜芯片檢測的結(jié)果,在表達(dá)下調(diào)的miRNA中,發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞自噬相關(guān)的miRNA-1-3p在AB中表達(dá)下調(diào)顯著,在AB中的表達(dá)量僅為NOM的0.06倍。經(jīng)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),miRNA-1-3p可能為LAMP2的上游調(diào)控分子,選定miRNA-1-3p為進(jìn)一步研究對象。(4)qRT-PCR結(jié)果顯示,在AB組織與NOM組織中、AM-1與Hacat中,LAMP2表達(dá)上調(diào),miRNA-1-3p表達(dá)下調(diào),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。(5)Spearman相關(guān)分析發(fā)現(xiàn),AB組織中LAMP2的表達(dá)與miRNA-1-3p的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.888,P0.05)。1、結(jié)論:(1)AB組織中自噬水平升高,溶酶體活性增強(qiáng),可能與AB易復(fù)發(fā)及局部侵襲的生物學(xué)行為有關(guān)。(2)LC3和LAMP2在AB中高表達(dá),可作為AB診斷的參考標(biāo)記物。(3)miRNA-1-3p在AB中表達(dá)下調(diào),其可能是LAMP2潛在的上游調(diào)控分子,可通過靶向調(diào)控LAMP2影響AB自噬,并進(jìn)一步影響其生物學(xué)行為。
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R739.8
【圖文】：

細(xì)胞質(zhì)

（1）Beclin1 的表達(dá)與分布Beclin1 以在細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達(dá)。免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，Beclin1 在 NOM 中多呈陽性表達(dá)（圖 3.1）；Beclin1 在 AB 中主要分布于 AB 上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，陽性率高時細(xì)胞核亦有著色。在 104 例 AB 組織中Beclin1 的陽性表達(dá)率為 50%（52/104），顯著低于 NOM 組織（95%，19/20）差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。Image J 定量分析結(jié)果顯示，Beclin1 在 NOM 中的表達(dá)是 AB 中的 1.51 倍（P＜0.05），見表 3.1 及圖 3.3。（2）Beclin1 的表達(dá)與 AB 患者臨床病理因素的關(guān)系按 2017 年 WHO 頭頸部腫瘤分類第 4 版將 104 例 AB 進(jìn)行分型：實性/多型占 79.81%（83/104），單囊型占 11.53%（12/104），骨外/外周型占 5.77%（6/104）促結(jié)締組織增生型占 2.88%（3/104）。Beclin1 在 AB 各病理分型中均有表達(dá)（圖3.2）。AB 中 Beclin1 的表達(dá)在患者年齡、性別、病變部位、病理分型及是否復(fù)發(fā)方面的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），見表 3.2。

細(xì)胞質(zhì),細(xì)胞核,頭頸部腫瘤,多型