【摘要】：本課題結(jié)合牙胚發(fā)育生物學(xué)、干細(xì)胞生物學(xué)及組織工程技術(shù)的有關(guān)研究成果和方法,探索性地分離培養(yǎng)牙胚發(fā)生的上游干細(xì)胞—顱神經(jīng)嵴干細(xì)胞(cranial neural crest stem cell, CNCSC),并以其為種子細(xì)胞,進(jìn)行成牙本質(zhì)樣細(xì)胞表型分化的定向誘導(dǎo),旨在確立CNCSC用于牙再生的可行性,為進(jìn)一步開展功能性牙組織工程研究奠定理論和方法學(xué)基礎(chǔ)。 顱神經(jīng)管組織塊無血清條件培養(yǎng)法分離培養(yǎng)CNCSC,形態(tài)學(xué)、BurdU滲入及免疫熒光細(xì)胞化學(xué)等方法鑒定其生物學(xué)性狀及干細(xì)胞特征。原代培養(yǎng)的CNCSC形態(tài)上呈梭形成纖維樣細(xì)胞,特異性標(biāo)記物HNK-1陽性表達(dá);表現(xiàn)為克隆樣生長、自我更新以及在不同誘導(dǎo)條件下出現(xiàn)多向分化能力等干細(xì)胞特征。本實(shí)驗(yàn)成功地獲取CNCSC,并呈現(xiàn)多潛能干細(xì)胞的生物學(xué)性狀,為研究其牙向分化誘導(dǎo)確立細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。 無血清條件培養(yǎng)法培養(yǎng)顱神經(jīng)管組織塊,通過Hoxa2原位雜交及vimentin免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色鑒定細(xì)胞分化表型。結(jié)果發(fā)現(xiàn),遷出前顱神經(jīng)嵴細(xì)胞在100ng/ml FGF8作用下,呈現(xiàn)第一鰓弓外胚間充質(zhì)細(xì)胞表型分化,呈現(xiàn)Hoxa2陰性表達(dá)而vimentin陽性表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)證實(shí),FGF8可誘導(dǎo)CNCSC向第一鰓弓外胚間充質(zhì)細(xì)胞表型分化,且具有早期誘導(dǎo)時(shí)相性特征,為進(jìn)一步誘導(dǎo)其牙向分化提供理論及實(shí)驗(yàn)
【學(xué)位授予單位】：四川大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號(hào)】：R78
【圖文】：

圈ZcCNCSC特異性標(biāo)記物剛K一1陽性表達(dá)(免疫細(xì)胞化學(xué)熒光x200)圖3acNCSc的體外生長曲線圖3bCNCSc的自我更新能力，表現(xiàn)為胞核攝取BudrU后檢測(cè)陽性圖3cCNCSC形成的克隆(相差顯微鏡x100)

6一9天增殖速度減慢進(jìn)入平臺(tái)期，細(xì)胞生長曲線呈S形(圖3)a。CNCSC經(jīng)BurdU孵育后，免疫細(xì)胞熒光化學(xué)標(biāo)記呈胞核陽性，BurUd被大多數(shù)細(xì)胞攝取，參與胞核DNA的合成代謝(圖3b)，說明cNCSc具有較強(qiáng)的自我更新能力。傳代后2天見細(xì)胞呈集落樣生長，1Xl擴(kuò)細(xì)胞密度在14天后可形成20個(gè)左右克隆(圖3c)。2.4NCCSC的多向分化CNCSc經(jīng)血清及BMPZ誘導(dǎo)后出現(xiàn)明顯分化，形態(tài)改變顯著，呈細(xì)長神經(jīng)樣細(xì)胞(圖4)a;7天后可見細(xì)胞呈多突起樹枝狀，14天后見突起進(jìn)一步分枝變長，并交互連接呈網(wǎng)狀(圖b4)。NCcCS經(jīng)血清及礦化液誘導(dǎo)后由原來的梭形轉(zhuǎn)變成不規(guī)則多角形，胞體鋪展明顯，胞漿豐滿，呈骨樣細(xì)胞(圖4c)

參與胞核DNA的合成代謝(圖3b)，說明cNCSc具有較強(qiáng)的自我更新能力。傳代后2天見細(xì)胞呈集落樣生長，1Xl擴(kuò)細(xì)胞密度在14天后可形成20個(gè)左右克隆(圖3c)。2.4NCCSC的多向分化CNCSc經(jīng)血清及BMPZ誘導(dǎo)后出現(xiàn)明顯分化，形態(tài)改變顯著，呈細(xì)長神經(jīng)樣細(xì)胞(圖4)a;7天后可見細(xì)胞呈多突起樹枝狀，14天后見突起進(jìn)一步分枝變長，并交互連接呈網(wǎng)狀(圖b4)。NCcCS經(jīng)血清及礦化液誘導(dǎo)后由原來的梭形轉(zhuǎn)變成不規(guī)則多角形，胞體鋪展明顯，胞漿豐滿，呈骨樣細(xì)胞(圖4c)，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，細(xì)胞重疊生長，礦化結(jié)節(jié)形成并逐漸融合(圖4d)，誘導(dǎo)后20天茜素紅染色?

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 朱鋒;小鼠牙本質(zhì)涎磷蛋白基因轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)成體間充質(zhì)干細(xì)胞牙向分化的實(shí)驗(yàn)研究[D];四川大學(xué);2006年

本文編號(hào)：2744755