【摘要】：干細(xì)胞是指一類具有分化為各類型細(xì)胞能力的多潛能細(xì)胞,間充質(zhì)干細(xì)胞可以分化為肌肉、血管、神經(jīng)前體細(xì)胞,表皮干細(xì)胞能夠分化為神經(jīng)元、平滑肌細(xì)胞或脂肪細(xì)胞；脂肪干細(xì)胞能夠成骨、成軟骨和形成肌肉組織,說明這類型干細(xì)胞具有從一種組織定向分化為另一種組織細(xì)胞的能力。神經(jīng)干細(xì)胞長期以來被定義為：來源于神經(jīng)系統(tǒng)、能夠分化為神經(jīng)組織；具有自我更新并通過不對稱分裂產(chǎn)生子代干細(xì)胞的能力。上世紀(jì)80年代,有學(xué)者成功分離、培養(yǎng)出了小鼠的胚胎干細(xì)胞,并在體外將胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元、少突膠質(zhì)和星形膠質(zhì)細(xì)胞,由于胚胎干細(xì)胞的來源與倫理學(xué)上的限制,促使越來越多其他組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)。骨髓、脂肪組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞在特定誘導(dǎo)劑與微環(huán)境的的作用下具有分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞、施旺細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的能力。2001年本課題組分離、鑒定出滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞(synovial mesenchymal stem cells, SMSCs)是一種具有多向分化能力的間充質(zhì)干細(xì)胞,能夠在條件培養(yǎng)基的作用下向特定組織分化,研究發(fā)現(xiàn)SMSCs能夠向骨、軟骨、脂肪組織分化。 顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病(Temporomandibular disorders, TMD)是指精神因素,社會心理因素,外傷,微小創(chuàng)傷,牙合因素,免疫等多因素導(dǎo)致顳下頜關(guān)節(jié)及周圍咀嚼肌群生理功能、結(jié)構(gòu)與器質(zhì)性的改變。據(jù)統(tǒng)計在人群中的發(fā)病率達(dá)20%-40%,其臨床表現(xiàn)主要為顳下頜關(guān)節(jié)彈響,關(guān)節(jié)疼痛,關(guān)節(jié)雜音,而下頜運動障礙與疼痛,往往是患者就醫(yī)的主要原因。有學(xué)者報道,TMD中疼痛分為三種類型：1.顳下頜關(guān)節(jié)雙板區(qū)的滑膜水腫、充血,刺激該區(qū)的感覺神經(jīng)末梢形成疼痛。2.外傷性的骨髓腔外露形成的疼痛。3.不明原因的疼痛。對于前兩種疼痛類型可概括為炎性疼痛,是由于感覺神經(jīng)纖維被關(guān)節(jié)滑液中的神經(jīng)肽與促炎性細(xì)胞因子等物質(zhì)刺激而產(chǎn)生的疼痛,第三種不明原因的疼痛多是由于患者的精神與心理因素導(dǎo)致。國內(nèi)、外研究發(fā)現(xiàn),白細(xì)胞介素-1β (Interleukin-1β,IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6, IL-6)、(?)中瘤壞死因子-a (Tumor necrosis factor-α, TNF-α)是導(dǎo)致TMD疼痛最主要的炎性因子。在顳下頜關(guān)節(jié)炎癥性疼痛過程中,P物質(zhì)(substance P, SP)與降鈣激素相關(guān)肽(calcitonin gene related peptide, CGRP)是由顳下頜關(guān)節(jié)雙板區(qū)滑膜神經(jīng)末梢分泌的兩種主要的疼痛遞質(zhì)與TMD疼痛發(fā)生機制密切相關(guān)。在大鼠顳下頜關(guān)節(jié)炎性動物模型的實驗中,研究人員發(fā)現(xiàn)顳下頜關(guān)節(jié)盤周圍神經(jīng)末梢組織的長度與密度相比于對照組有明顯的增加,關(guān)節(jié)盤雙板區(qū)神經(jīng)末梢的神經(jīng)發(fā)生,促進了該區(qū)域神經(jīng)纖維標(biāo)記蛋白PGP9.5與疼痛物質(zhì)CGRP的表達(dá)升高,而神經(jīng)生長因子NGF受體抑制劑K252A能夠降低由NGF導(dǎo)致的疼痛,說明顳下頜關(guān)節(jié)盤周圍神經(jīng)發(fā)生參與了顳下頜關(guān)節(jié)疼痛的改變。 在TMD臨床治療中,高分子量透明質(zhì)酸(High molecular weight-Hyaluronic acid, Hmw-HA)被廣泛應(yīng)用。HA是構(gòu)成關(guān)節(jié)滑液的主要成分,對顳下頜關(guān)節(jié)的生理功能起著至關(guān)重要的作用。目前,臨床上使用1%高分子量的透明質(zhì)酸進行顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病患者的關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射治療,旨在通過補充外源性HA,恢復(fù)滑液的潤滑功能,促進軟骨的修復(fù),改善關(guān)節(jié)功能,緩解患者的疼痛。因此,在本研究中,探討高分子量的HA能否抑制神經(jīng)化的SMSCs導(dǎo)致的神經(jīng)肽的分泌,將為臨床上使用高分子量HA治療TMD關(guān)節(jié)疼痛提供理論依據(jù)。 本研究從人顳下頜關(guān)節(jié)滑膜組織中,分離、純化、培養(yǎng)出SMSCs,首次應(yīng)用bFGF定向誘導(dǎo)SMSCs向神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化；觀察神經(jīng)化的SMSCs與正常SMSCs在神經(jīng)肽SP、CGRP的作用下炎性因子IL-1β,IL-6與TNF-α的表達(dá),探討神經(jīng)肽SP、CGRP與顳下頜關(guān)節(jié)炎性因子之間的關(guān)系,以及高分子量的HA對疼痛物質(zhì)的抑制作用,為進一步了解TMD滑膜炎導(dǎo)致的疼痛發(fā)生、發(fā)展過程提供實驗依據(jù)。本研究分為以下兩部分： 第一部分人顳下領(lǐng)關(guān)節(jié)滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞神經(jīng)化的實驗研究 目的：通過分離培養(yǎng)人顳下頜關(guān)節(jié)(Temporomandibular Joints, TMJ)滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞(synovial mesenchymal stem cells, SMSCs)并誘導(dǎo)其向神經(jīng)細(xì)胞分化,研究滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞神經(jīng)化的潛能。 方法：實驗中采用組織塊法分離、純化培養(yǎng)人滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞,采用一定濃度胎牛血清(fetal calf serum, FCS)與條件培養(yǎng)基進行體外培養(yǎng)擴增,使用25ng/ml的堿性成纖維生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)誘導(dǎo)SMSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化。采用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化；掃描電鏡觀察分化后的神經(jīng)樣細(xì)胞的形態(tài)；采用免疫細(xì)胞化學(xué)、RT-PCR與流式細(xì)胞術(shù)檢測SMSCs在誘導(dǎo)前后對特異性神經(jīng)干細(xì)胞與早期神經(jīng)元表面標(biāo)記物Nestin、NF-L的表達(dá)。 結(jié)果：倒置顯微鏡下可見SMSCs呈現(xiàn)成纖維細(xì)胞的形態(tài),bFGF誘導(dǎo)7天后的SMSCs胞體部存在典型的神經(jīng)細(xì)胞樣突觸伸出,部分細(xì)胞呈現(xiàn)多個長軸突樣的突觸,細(xì)胞之間呈現(xiàn)出網(wǎng)狀的連接。免疫細(xì)胞化學(xué)、RT-PCR與流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)大部分細(xì)胞表達(dá)特異性神經(jīng)干細(xì)胞Nestin與早期神經(jīng)元表面標(biāo)記物NF-L 結(jié)論：通過bFGF能夠在體外誘導(dǎo)人滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化。使用bFGF誘導(dǎo)人的滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞不僅在形態(tài)學(xué)上有神經(jīng)樣細(xì)胞的改變,而且能夠在蛋白、基因水平表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞與早期神經(jīng)元的特異性標(biāo)記物。 第二部分人顳下頜關(guān)節(jié)滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞神經(jīng)化與疼痛的相關(guān)研究 目的：通過觀察神經(jīng)肽SP與CGRP刺激SMSCs與神經(jīng)化的SMSCs分泌炎性因子的能力,在炎性因子環(huán)境下的SMSCs與神經(jīng)化的SMSCs中加入高分子量HA,評價炎性因子與神經(jīng)肽之間的協(xié)同刺激作用,檢測高分子量HA對神經(jīng)肽SP、CGRP表達(dá)的抑制作用。 方法：實驗中采用組織塊法分離、純化培養(yǎng)人滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞,使用bFGF誘導(dǎo)SMSCs神經(jīng)化,利用免疫細(xì)胞化學(xué)檢測神經(jīng)化的SMSCs與SMSCs中神經(jīng)肽SP、CGRP的表達(dá)水平；使用神經(jīng)肽SP與CGRP刺激SMSCs與神經(jīng)化的SMSCs兩種細(xì)胞,通過ELISA觀察炎性因子IL-1β,IL-6與TNF-α在神經(jīng)肽環(huán)境下的濃度依賴性與時間依賴性。利用IL-1β,IL-6與TNF-α建立一種體外炎性疼痛模式,觀察在炎癥環(huán)境下SMSCs與神經(jīng)化的SMSCs兩種細(xì)胞神經(jīng)肽表達(dá)量的差異,并通過使用RT-PCR、Western blotting檢測高分子量的HA在這種炎性環(huán)境下對神經(jīng)肽SP、CGRP的抑制作用。 結(jié)果：免疫細(xì)胞化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn),神經(jīng)化的SMSCs細(xì)胞胞漿與軸突內(nèi)有明顯的SP.CGRP陽性棕黃色染色,著色均勻；對照組中SMSCs細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生改變,部分細(xì)胞胞漿淡染,未出現(xiàn)較長的神經(jīng)樣細(xì)胞軸突與軸突染色,使用Image-Pro Plus6.0半定量分析圖片,實驗組與對照組之間CGRP、SP的表達(dá)具有統(tǒng)計學(xué)差異；ELISA檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),神經(jīng)化的SMSCs在神經(jīng)肽SP與CGRP的刺激下IL-1β,IL-6與TNF-α的表達(dá)明顯高于SMSCs組。在炎癥環(huán)境下,神經(jīng)化的SMSCs疼痛物質(zhì)SP與CGRP在蛋白、基因水平的表達(dá)量明顯高于SMSCs組,而高分子量的HA能夠明顯抑制神經(jīng)化后的SMSCs神經(jīng)肽SP與CGRP的表達(dá)。 結(jié)論：通過使用bFGF誘導(dǎo)的人SMSCs(?)經(jīng)化細(xì)胞具有表達(dá)神經(jīng)肽SP、CGRP的能力；神經(jīng)肽SP、CGRP與炎性因子IL-1β,IL-6與TNF-α能夠相互作用于神經(jīng)化的SMSCs,并體現(xiàn)出一種協(xié)同刺激作用。高分子量的HA可能參與了抑制神經(jīng)化SMSCs分泌神經(jīng)肽SP、CGRP的過程。
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R782.2

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本文編號：2743962