【摘要】： 目的:(1)承接本課題組前期試驗(yàn),根據(jù)NGF,VEGF基因表達(dá)序列,構(gòu)建靶向NGF,VEGF基因的shRNA真核表達(dá)載體質(zhì)粒。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌,擴(kuò)增后重新提取質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染Acc-M細(xì)胞。研究靶向NGF,VEGF基因的shRNA真核表達(dá)載體質(zhì)粒的抑制效果。(2)檢測(cè)神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF),血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEG)的受體TrkA,VEGFR2在47例不同病理分型涎腺腺樣囊性癌(SACC)患者癌組織中的表達(dá)情況,結(jié)合47例病例隨訪資料,研究以上因子受體表達(dá)程度的高低與涎腺腺樣囊性癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的相關(guān)性。 方法:(1)根據(jù)NGF,VEGF的基因序列,設(shè)計(jì)并構(gòu)建靶向NGF,VEGF基因的shRNA真核表達(dá)載體質(zhì)粒,采用酶切電泳,質(zhì)粒序列檢測(cè)等方法檢測(cè)重組質(zhì)粒合成情況。(2)將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)大腸桿菌,擴(kuò)增后重新提取質(zhì)粒。采用LipofectamineTM 2000脂質(zhì)體介導(dǎo)NGF,VEGF基因shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Acc-M細(xì)胞系,RT-PCR,Western-blot檢測(cè)質(zhì)粒對(duì)NFG,VEGF生長(zhǎng)因子的抑制效果。(3)免疫組化方法檢測(cè)不同病理分型涎腺腺樣囊性癌患者癌組織中TrkA,VEGFR2的表達(dá)情況。采用德國(guó)萊卡病理圖像分析儀(DMR+Q550型)進(jìn)行免疫組化結(jié)果分析,結(jié)合47例病例隨訪資料分析研究TrkA,VEGFR2在SACC侵襲,轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)中的作用。 結(jié)果:1、采用pGenesil1.1載體構(gòu)建的靶向NGF,VEGF的shRNA表達(dá)載體質(zhì)粒,成功轉(zhuǎn)化DH5α宿主菌。經(jīng)測(cè)序鑒定,表明序列完全一致。成功構(gòu)建靶向NGF,VEGF基因的shRNA表達(dá)載體質(zhì)粒。 2、采用LipofectamineTM 2000進(jìn)行脂質(zhì)體介導(dǎo)NGF,VEGF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Acc-M細(xì)胞72小時(shí)內(nèi)采用RT-PCR,Western blot試驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染組抑制效果發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中NGF,VEGF生長(zhǎng)因子的表達(dá)顯著低于非轉(zhuǎn)染組,陰性對(duì)照組及空質(zhì)粒組。 3、TrkA、VEGFR2在SACC組織中的陽(yáng)性率分別是87.23%(41/47例)和85.1%(40/47例),在是否有神經(jīng)侵襲、復(fù)發(fā)以及病理類型是否為實(shí)性形或者腺樣管狀性的患者的組織切片中TrkA和VEGFR2表達(dá)率均有不同,且差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);組織內(nèi)微血管密度(MVD)計(jì)數(shù)與VEGFR2的表達(dá)率成正相關(guān)關(guān)系,P＜0.05。MVD在復(fù)發(fā)組為26.58±2.38,無(wú)復(fù)發(fā)組為19.06±1.39,兩者相差顯著(P＜0.05);MVD在神經(jīng)侵襲組為25.14±2.83,在無(wú)神經(jīng)侵襲組為18.81±1.33,兩者相差顯著(P＜0.05)。 結(jié)論:1、采用pGenesil1.1載體構(gòu)建靶向NGF,VEGF的shRNA表達(dá)載體質(zhì)粒能有效抑制腺樣囊性癌細(xì)胞中NGF,VEGF在mRNA和蛋白水平的表達(dá)。 2、TrkA、VEGFR2在SACC的侵襲轉(zhuǎn)移中可能具有重要作用,由此推測(cè)TrkA、VEGFR2可以作為評(píng)價(jià)涎腺腺樣囊性癌患者預(yù)后的指標(biāo)。
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R739.8
【圖文】：

NGFZ圖2ShRNA測(cè)序結(jié)果3、靶向NGF，VEGF基因shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染ACC一M細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h后，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞，可見部分發(fā)出綠色熒光，說(shuō)明重組質(zhì)粒己成功轉(zhuǎn)染到ACC一M細(xì)胞(見圖3)。轉(zhuǎn)染試劑濃度根據(jù)試劑說(shuō)明書推薦濃度上下浮動(dòng)，設(shè)定濃度梯度，用空載體轉(zhuǎn)染做對(duì)照取消背景干擾。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染6孔板時(shí)，質(zhì)粒8pg八ipofeetamineZ0006pl組轉(zhuǎn)染效率最高，約為60%。

圖 4RT一PCR產(chǎn)物1.5%瓊脂糖凝膠電泳圖 (1)pGenesin.1一NGFmRNA表達(dá)比密度t匕值分別為:空白對(duì)照組(0.821士HK陰性對(duì)照組(0.851士0.023)、SIRNA組士0.028)。SIRNA組與對(duì)照組差別有統(tǒng)質(zhì)粒組，陰性對(duì)照組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(2)pGenesil一2一vEGFm朋A表達(dá)光密度比值分別為:空白對(duì)照組(0 0.031)、HK陰性對(duì)照組(0.845士0.037組2(0.612士0.034)。SIRNA組與對(duì)照對(duì)照組，空質(zhì)粒組，陰性對(duì)照組之間無(wú)

一actin、飛GF

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 李昊;RNA干擾血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)對(duì)舌癌耐藥細(xì)胞移植瘤的影響[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2011年

2 黃艷;shRNA-VEGF對(duì)舌癌Tca/DDP細(xì)胞系生長(zhǎng)及VEGF表達(dá)的影響[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2010年

本文編號(hào)：2742993