【摘要】：目的:1.分離培養(yǎng)棕色脂肪干細(xì)胞(Brown Adipose-derived mesenchymal stem cells BADSCs)和白色脂肪干細(xì)胞(White Adipose-derived mesenchymal stem cells WADSCs),并對(duì)兩種細(xì)胞進(jìn)行鑒定及生長(zhǎng)動(dòng)力研究。2.比較BADSCs和WADSCs體外成脂、成骨及成軟骨能力,為組織工程種子細(xì)胞的選擇提供理論依據(jù)。3.分別研究不同miRNA在ADSCs成軟骨分化中的作用,以及不同miRNA在ADSCs成軟骨分化中的協(xié)同作用,并試圖探究其作用機(jī)制。方法:1.分離SD大鼠棕色及白色脂肪組織,得到BADSCs和WADSCs。倒置顯微鏡觀察兩種細(xì)胞的形態(tài)、細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)增殖能力、流式儀鑒定細(xì)胞表面抗原標(biāo)記物。2.將BADSCs和WADSCs進(jìn)行成脂、成骨和成軟骨誘導(dǎo)。兩種細(xì)胞成脂后進(jìn)行油紅-O染色,成骨后進(jìn)行堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase ALP)活性檢測(cè)及茜素紅染色,成軟骨后進(jìn)行阿辛藍(lán)染色。qRT-PCR進(jìn)一步檢測(cè)兩種細(xì)胞成脂、成骨、成軟骨相關(guān)基因的表達(dá)水平。3.通過qRT-PCR檢測(cè)ADSCs軟骨向分化過程中,miR-99a和miR-127-5p時(shí)間相關(guān)的表達(dá)趨勢(shì)。隨后將miR-99a-inhibitor和miR-127-5p-mimic通過lipofectamine2000遞送至ADSCs,遞送miR-99a-inhibitor的ADSCs指定為M組,遞送miR-127-5p-mimic的ADSCs指定為N組,遞送miR-99a-inhibitor和miR-127-5p-mimic的ADSCs指定為M+N組,沒有進(jìn)行處理的ADSCs充當(dāng)陰性對(duì)照(NC組)。24小時(shí)后通過qRT-PCR檢測(cè)ADSCs內(nèi)miR-99a和miR-127-5p的含量,并通過MTT法檢測(cè)四組細(xì)胞的增殖能力。4.四組ADSCs進(jìn)行成軟骨誘導(dǎo),qRT-PCR檢測(cè)軟骨標(biāo)志基因II型膠原蛋白(Type II collagen-A1 COL2A1)和聚集蛋白多糖(Aggrecan ACAN)mRNA的表達(dá)水平,Western Blot檢測(cè)COL2A1和ACAN蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。結(jié)果:1.分離培養(yǎng)BADSCs和WADSCs,細(xì)胞貼壁后,倒置顯微鏡觀察,二者形態(tài)類似,WADSCs胞體較BADSCs大;流式儀鑒定二者表面抗原標(biāo)記物,均符合間充質(zhì)干細(xì)胞的特征;細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)增殖能力表明WADSCs強(qiáng)于BADSCs。2.BADSCs和WADSCs都具有成脂分化能力。與BADSCs相比,WADSCs中脂滴形成相對(duì)較快且數(shù)量較多,相同時(shí)間點(diǎn)成脂標(biāo)志基因PPAR、C/EBPB表達(dá)也相對(duì)較高;BADSCs和WADSCs均可成骨向分化。成骨誘導(dǎo)后相同時(shí)間點(diǎn)BADSCs的ALP活性較大,且5周時(shí)茜素紅染色面積大于WADSCs。Runx2、OCN基因的表達(dá)也相對(duì)較高;BADSCs和WADSCs都具有成軟骨分化能力。兩種細(xì)胞切片的阿辛藍(lán)染色和COL2A1、ACAN基因的表達(dá)量并無明顯區(qū)別。3.MiR-99a-inhibitor和miR-127-5p-mimic通過lipofectamine2000遞送至ADSCs,24小時(shí)后qRT-PCR檢測(cè)到miR-99a的量低于NC組和miR-127-5p的量高于NC組;通過MTT實(shí)驗(yàn)測(cè)得四組ADSCs的增殖能力無明顯差異。4.四組細(xì)胞用成軟骨培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)后,檢測(cè)到M組和N組COL2A1、ACAN基因和蛋白水平的表達(dá)量高于NC組,M+N組COL2A1、ACAN基因和蛋白水平的表達(dá)量高于M組和N組。結(jié)論:1.本實(shí)驗(yàn)方法可較為快速的提取BADSCs和WADSCs并進(jìn)行純化。提取的BADSC和WADSCs都具有較強(qiáng)的增殖能力,可擴(kuò)增為大量細(xì)胞,用于實(shí)驗(yàn)研究。2.BADSCs和WADSCs均具有成脂分化能力,但WADSCs成脂分化能力較強(qiáng);BADSCs和WADSCs均具有成骨分化能力,但BADSCs成骨分化能力較強(qiáng);BADSCs和WADSCs均具有成軟骨分化能力,且二者成軟骨分化能力無明顯差異。3.MiR-99a和miR-127-5p在ADSCs的軟骨分化中均可起到一定的調(diào)節(jié)作用,miR-99a在ADSCs的軟骨分化中可起到抑制即負(fù)調(diào)節(jié)作用,miR-127-5p在ADSCs的軟骨分化中可起到促進(jìn)即正調(diào)節(jié)作用。MiR-99a-inhibitor可削弱miR-99a的負(fù)調(diào)節(jié)作用與正調(diào)節(jié)因子miR-127-5p協(xié)同促進(jìn)ADSCs的軟骨分化。
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R78
【圖文】：

（3） 在超凈臺(tái)內(nèi)分離肩胛骨下和腹股溝脂肪組織（圖 1-1）。將獲取的脂肪組織浸泡在預(yù)冷的 PBS 里；（4） 去除血管和筋膜組織，PBS 沖洗 3-4 次；（5） 分離成體積大小為 1mm3的組織小塊；（6） 將剪碎的脂肪組織小塊移入含有玻璃球、磁力攪拌器轉(zhuǎn)子、酶消化液（由體積比為 4：4：1：1 的 HG—DMEM、0.25%EDTA 一胰酶消化液、Dispase、Ⅳ膠原酶配制）的玻璃瓶；（7） 磁力攪拌器低轉(zhuǎn)速下，孵箱中旋轉(zhuǎn)消化 30-40min 左右；終止消化后，過濾懸液；（8） 以 1000rpm，5min 離心濾液，收集細(xì)胞，再加入 α- MEM（含 10% FBS）重懸，計(jì)數(shù)；（9） 接種，孵箱中常規(guī)培養(yǎng)；（10） 24h 后換液，以后隔 2 天換 1 次培養(yǎng)基，細(xì)胞長(zhǎng)滿 80%左右，消化傳代培養(yǎng)。

（1） 從第 1 代開始，將 ADSCs 消化，重懸，計(jì)數(shù)；（2） 接種于 6 孔板，密度為 2.5×105個(gè)/孔。培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 3d 后，第 2 代細(xì)胞胰酶消化后使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，每個(gè)樣本取 3 個(gè)孔，計(jì)算均值；（3） 計(jì)數(shù)并離心后重懸細(xì)胞，以相同密度再次接種于 6 孔板為 P3 代，相同方法計(jì)數(shù)并記錄；（4） P4～P9 代細(xì)胞利用上述方法依次進(jìn)行計(jì)數(shù)并記錄。1.3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用 SPSS18.0 軟件分析數(shù)據(jù)，結(jié)果用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表達(dá)數(shù)據(jù)；進(jìn)行單因素方差分析，或 t 檢驗(yàn)。以雙側(cè) P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2 結(jié) 果2.1 BADSCs 和 WADSCs 的形態(tài)學(xué)觀察

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 閆繼紅;楊姝;孫海梅;曹丹丹;張秀英;季鳳清;郭多;吳波;孫婷怡;周德山;;共沉默miR-221-3p/222-3p表達(dá)抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及促成軟骨分化[J];中國組織工程研究;2015年50期

2 魏于全;杭振鑣;;間葉源性軟骨肉瘤向纖維軟骨分化(附1例光鏡、組織化學(xué)及電鏡觀察)[J];華西醫(yī)訊;1989年02期

3 陳波;張壽;;誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨分化的影響因素研究進(jìn)展[J];海南醫(yī)學(xué);2013年10期

4 修忠標(biāo),林建華;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞軟骨分化生物學(xué)的影響因素[J];骨與關(guān)節(jié)損傷雜志;2004年08期

5 方楚玲;田京;;間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化相關(guān)研究進(jìn)展[J];國際骨科學(xué)雜志;2014年01期

6 雍志軍;賈帥軍;韓林章;周翔;戶剛;郝賦;劉建;;富血小板纖維蛋白對(duì)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化的影響[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2014年08期

7 黃弘軒;張姝江;白波;;調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化的研究進(jìn)展[J];中華關(guān)節(jié)外科雜志(電子版);2017年06期

8 邱靜怡;萬凌云;趙志河;李娟;;內(nèi)外源性應(yīng)力對(duì)間質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化的調(diào)控[J];國際口腔醫(yī)學(xué)雜志;2016年04期

9 張宇坤;楊述華;孫立;楊操;田洪濤;徐亮;;生長(zhǎng)分化生長(zhǎng)因子-5在誘導(dǎo)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞軟骨分化中的作用[J];中華創(chuàng)傷雜志;2006年12期

10 陳俠甫;金旭紅;黃鄧高;邢勢(shì);王和杰;卓澤銘;車家駒;;低強(qiáng)度脈沖超聲對(duì)人臍帶干細(xì)胞體外增殖和成軟骨分化的影響[J];中國康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志;2019年05期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 劉天一;周廣東;魏嫻;陳付國;呂曉杰;劉霞;陳瑾君;崔磊;劉偉;曹誼林;;力學(xué)刺激促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞體外軟骨分化[A];第4屆中國美容與整形醫(yī)師大會(huì)論文匯編[C];2007年

2 鄭有華;張志光;蘇凱;匡世軍;;成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子促進(jìn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨和成軟骨分化的實(shí)驗(yàn)研究[A];第八屆全國顳下頜關(guān)節(jié)病學(xué)及（牙合）學(xué)大會(huì)論文匯編[C];2011年

3 岑嘯;張美;龐欣;吳敬飚;余祥華;湯亞玲;梁新華;;轉(zhuǎn)錄因子Prrx1對(duì)人脂肪干細(xì)胞成骨、成軟骨分化的影響及機(jī)制初探[A];2018口腔病理年會(huì)暨第十二次全國口腔病理學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2018年

4 譚磊;孫大輝;;腺苷及腺苷A2B受體在沖擊波抑制人類骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨分化中的作用及機(jī)制研究[A];第十二屆全國生物力學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議暨第十四屆全國生物流變學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議會(huì)議論文摘要匯編[C];2018年

5 萬凌云;李娟;趙志河;唐舸;孫勇;;YAP/TAZ過表達(dá)對(duì)不同基質(zhì)硬度影響間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化過程的作用[A];中華口腔醫(yī)學(xué)會(huì)第九次全科口腔醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2018年

6 房維;肖殷;龍星;;軟骨缺損模型體內(nèi)軟骨分化的實(shí)驗(yàn)研究[A];第九次全國顳下頜關(guān)節(jié)病學(xué)及(牙合)學(xué)研討會(huì)論文匯編[C];2012年

7 韋孔昌;朱美靈;邊黎明;;用于軟骨修復(fù)的多功能自組裝囊泡的制備[A];2015年全國高分子學(xué)術(shù)論文報(bào)告會(huì)論文摘要集——主題F-生物醫(yī)用高分子[C];2015年

8 李娟;王軍;趙志河;;MAPK信號(hào)通路在大鼠BMSCs成軟骨分化過程中的力學(xué)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究[A];第十一屆全國生物力學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議暨第十三屆全國生物流變學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議會(huì)議論文摘要匯編[C];2015年

9 黃俊武;葉菊花;張春梅;黃偉;吳陳歡;胡國鵬;周曉武;;HIF-2a在小鼠間質(zhì)干細(xì)胞C3H10T1/2成軟骨分化中表達(dá)抑制[A];中國中藥雜志2015/專集：基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)從業(yè)人員科技論文寫作培訓(xùn)會(huì)議論文集[C];2016年

10 齊勇建;李斌;陳廖斌;;TGFβRs去乙�；閷�(dǎo)糖皮質(zhì)激素編程IUGR子代軟骨分化不良及OA樣表型易感[A];2017年生殖毒理藥理學(xué)理論與技術(shù)及科技產(chǎn)品研發(fā)學(xué)術(shù)交流會(huì)論文集[C];2017年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 劉劍偉;碳點(diǎn)介導(dǎo)siTnfα調(diào)控炎癥促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化的研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2019年

2 蔣超;血清纖維黏連蛋白促晚期骨關(guān)節(jié)炎患者軟骨下松質(zhì)骨祖細(xì)胞軟骨分化[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2014年

3 唐仲文;骨不連細(xì)胞體外培養(yǎng)及壓應(yīng)力刺激對(duì)其成軟骨分化影響的研究[D];中南大學(xué);2014年

4 王亮;人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨及成軟骨分化中長(zhǎng)鏈非編碼RNA的初步研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2015年

5 劉姍姍;7，8-二羥基香豆素促進(jìn)大鼠脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及成軟骨分化的研究[D];吉林大學(xué);2012年

6 曲峰;Wnt3a對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化影響的研究[D];南開大學(xué);2013年

7 白曉卉;ADAMTS-7和ADAMTS-12抑制軟骨分化的功能研究[D];山東大學(xué);2009年

8 房維;軟骨調(diào)節(jié)素-1在顳下頜關(guān)節(jié)軟骨及軟骨分化中的表達(dá)[D];武漢大學(xué);2010年

9 叢銳軍;滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞向纖維軟骨分化的條件及分子機(jī)制研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2013年

10 王大偉;1、GEP蛋白在骨骼肌分化過程中的功能研究 2、ADAMTS-12抑制軟骨分化的功能研究[D];山東大學(xué);2009年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 馮頂麗;MiR-127-5p-mimic和MiR-99a-inhibitor協(xié)同促進(jìn)脂肪干細(xì)胞成軟骨分化的相關(guān)研究[D];山西醫(yī)科大學(xué);2019年

2 繆志康;蛇毒神經(jīng)生長(zhǎng)因子調(diào)控自噬誘導(dǎo)BMSCs成軟骨分化的作用及其機(jī)制研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2018年

3 魏媛媛;KDM6A對(duì)牙周膜干細(xì)胞成軟骨分化中MiR-204和MiR-211表達(dá)的影響及意義[D];天津醫(yī)科大學(xué);2018年

4 常崇斐;PPARδ激動(dòng)劑對(duì)人關(guān)節(jié)液來源的間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化及抗炎效果的影響[D];廣州醫(yī)科大學(xué);2018年

5 吳玉喜;共培養(yǎng)誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化以及培養(yǎng)方式對(duì)軟骨細(xì)胞表型的影響[D];華東理工大學(xué);2018年

6 馮江峰;Kartogenin通過調(diào)節(jié)SOX9促進(jìn)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化的實(shí)驗(yàn)研究[D];山西醫(yī)科大學(xué);2018年

7 王志寬;兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與Buffy coat體外軟骨分化的比較分析[D];延邊大學(xué);2017年

8 楊以萌;發(fā)散式?jīng)_擊波對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)成軟骨分化影響[D];中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院;2017年

9 楊丹聃;無血清條件培養(yǎng)基法誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞成軟骨分化的研究[D];吉林大學(xué);2015年

10 黃朋;兔脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)鑒定及成軟骨分化的實(shí)驗(yàn)研究[D];華中科技大學(xué);2012年

本文編號(hào)：2741319