【摘要】：目的:1.分離培養(yǎng)棕色脂肪干細胞(Brown Adipose-derived mesenchymal stem cells BADSCs)和白色脂肪干細胞(White Adipose-derived mesenchymal stem cells WADSCs),并對兩種細胞進行鑒定及生長動力研究。2.比較BADSCs和WADSCs體外成脂、成骨及成軟骨能力,為組織工程種子細胞的選擇提供理論依據(jù)。3.分別研究不同miRNA在ADSCs成軟骨分化中的作用,以及不同miRNA在ADSCs成軟骨分化中的協(xié)同作用,并試圖探究其作用機制。方法:1.分離SD大鼠棕色及白色脂肪組織,得到BADSCs和WADSCs。倒置顯微鏡觀察兩種細胞的形態(tài)、細胞計數(shù)檢測增殖能力、流式儀鑒定細胞表面抗原標記物。2.將BADSCs和WADSCs進行成脂、成骨和成軟骨誘導。兩種細胞成脂后進行油紅-O染色,成骨后進行堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase ALP)活性檢測及茜素紅染色,成軟骨后進行阿辛藍染色。qRT-PCR進一步檢測兩種細胞成脂、成骨、成軟骨相關基因的表達水平。3.通過qRT-PCR檢測ADSCs軟骨向分化過程中,miR-99a和miR-127-5p時間相關的表達趨勢。隨后將miR-99a-inhibitor和miR-127-5p-mimic通過lipofectamine2000遞送至ADSCs,遞送miR-99a-inhibitor的ADSCs指定為M組,遞送miR-127-5p-mimic的ADSCs指定為N組,遞送miR-99a-inhibitor和miR-127-5p-mimic的ADSCs指定為M+N組,沒有進行處理的ADSCs充當陰性對照(NC組)。24小時后通過qRT-PCR檢測ADSCs內(nèi)miR-99a和miR-127-5p的含量,并通過MTT法檢測四組細胞的增殖能力。4.四組ADSCs進行成軟骨誘導,qRT-PCR檢測軟骨標志基因II型膠原蛋白(Type II collagen-A1 COL2A1)和聚集蛋白多糖(Aggrecan ACAN)mRNA的表達水平,Western Blot檢測COL2A1和ACAN蛋白質(zhì)的表達水平。結(jié)果:1.分離培養(yǎng)BADSCs和WADSCs,細胞貼壁后,倒置顯微鏡觀察,二者形態(tài)類似,WADSCs胞體較BADSCs大;流式儀鑒定二者表面抗原標記物,均符合間充質(zhì)干細胞的特征;細胞計數(shù)檢測增殖能力表明WADSCs強于BADSCs。2.BADSCs和WADSCs都具有成脂分化能力。與BADSCs相比,WADSCs中脂滴形成相對較快且數(shù)量較多,相同時間點成脂標志基因PPAR、C/EBPB表達也相對較高;BADSCs和WADSCs均可成骨向分化。成骨誘導后相同時間點BADSCs的ALP活性較大,且5周時茜素紅染色面積大于WADSCs。Runx2、OCN基因的表達也相對較高;BADSCs和WADSCs都具有成軟骨分化能力。兩種細胞切片的阿辛藍染色和COL2A1、ACAN基因的表達量并無明顯區(qū)別。3.MiR-99a-inhibitor和miR-127-5p-mimic通過lipofectamine2000遞送至ADSCs,24小時后qRT-PCR檢測到miR-99a的量低于NC組和miR-127-5p的量高于NC組;通過MTT實驗測得四組ADSCs的增殖能力無明顯差異。4.四組細胞用成軟骨培養(yǎng)基進行誘導后,檢測到M組和N組COL2A1、ACAN基因和蛋白水平的表達量高于NC組,M+N組COL2A1、ACAN基因和蛋白水平的表達量高于M組和N組。結(jié)論:1.本實驗方法可較為快速的提取BADSCs和WADSCs并進行純化。提取的BADSC和WADSCs都具有較強的增殖能力,可擴增為大量細胞,用于實驗研究。2.BADSCs和WADSCs均具有成脂分化能力,但WADSCs成脂分化能力較強;BADSCs和WADSCs均具有成骨分化能力,但BADSCs成骨分化能力較強;BADSCs和WADSCs均具有成軟骨分化能力,且二者成軟骨分化能力無明顯差異。3.MiR-99a和miR-127-5p在ADSCs的軟骨分化中均可起到一定的調(diào)節(jié)作用,miR-99a在ADSCs的軟骨分化中可起到抑制即負調(diào)節(jié)作用,miR-127-5p在ADSCs的軟骨分化中可起到促進即正調(diào)節(jié)作用。MiR-99a-inhibitor可削弱miR-99a的負調(diào)節(jié)作用與正調(diào)節(jié)因子miR-127-5p協(xié)同促進ADSCs的軟骨分化。
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R78
【圖文】：

（3） 在超凈臺內(nèi)分離肩胛骨下和腹股溝脂肪組織（圖 1-1）。將獲取的脂肪組織浸泡在預冷的 PBS 里；（4） 去除血管和筋膜組織，PBS 沖洗 3-4 次；（5） 分離成體積大小為 1mm3的組織小塊；（6） 將剪碎的脂肪組織小塊移入含有玻璃球、磁力攪拌器轉(zhuǎn)子、酶消化液（由體積比為 4：4：1：1 的 HG—DMEM、0.25%EDTA 一胰酶消化液、Dispase、Ⅳ膠原酶配制）的玻璃瓶；（7） 磁力攪拌器低轉(zhuǎn)速下，孵箱中旋轉(zhuǎn)消化 30-40min 左右；終止消化后，過濾懸液；（8） 以 1000rpm，5min 離心濾液，收集細胞，再加入 α- MEM（含 10% FBS）重懸，計數(shù)；（9） 接種，孵箱中常規(guī)培養(yǎng)；（10） 24h 后換液，以后隔 2 天換 1 次培養(yǎng)基，細胞長滿 80%左右，消化傳代培養(yǎng)。

（1） 從第 1 代開始，將 ADSCs 消化，重懸，計數(shù)；（2） 接種于 6 孔板，密度為 2.5×105個/孔。培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 3d 后，第 2 代細胞胰酶消化后使用細胞計數(shù)板計數(shù)，每個樣本取 3 個孔，計算均值；（3） 計數(shù)并離心后重懸細胞，以相同密度再次接種于 6 孔板為 P3 代，相同方法計數(shù)并記錄；（4） P4～P9 代細胞利用上述方法依次進行計數(shù)并記錄。1.3.6 統(tǒng)計學處理采用 SPSS18.0 軟件分析數(shù)據(jù)，結(jié)果用“均數(shù)±標準差”的形式表達數(shù)據(jù)；進行單因素方差分析，或 t 檢驗。以雙側(cè) P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。2 結(jié) 果2.1 BADSCs 和 WADSCs 的形態(tài)學觀察

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 閆繼紅;楊姝;孫海梅;曹丹丹;張秀英;季鳳清;郭多;吳波;孫婷怡;周德山;;共沉默miR-221-3p/222-3p表達抑制骨髓間充質(zhì)干細胞增殖及促成軟骨分化[J];中國組織工程研究;2015年50期

2 魏于全;杭振鑣;;間葉源性軟骨肉瘤向纖維軟骨分化(附1例光鏡、組織化學及電鏡觀察)[J];華西醫(yī)訊;1989年02期

3 陳波;張壽;;誘導骨髓間充質(zhì)干細胞向軟骨分化的影響因素研究進展[J];海南醫(yī)學;2013年10期

4 修忠標,林建華;骨髓間充質(zhì)干細胞軟骨分化生物學的影響因素[J];骨與關節(jié)損傷雜志;2004年08期

5 方楚玲;田京;;間充質(zhì)干細胞成軟骨分化相關研究進展[J];國際骨科學雜志;2014年01期

6 雍志軍;賈帥軍;韓林章;周翔;戶剛;郝賦;劉建;;富血小板纖維蛋白對兔骨髓間充質(zhì)干細胞成軟骨分化的影響[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學進展;2014年08期

7 黃弘軒;張姝江;白波;;調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細胞成軟骨分化的研究進展[J];中華關節(jié)外科雜志(電子版);2017年06期

8 邱靜怡;萬凌云;趙志河;李娟;;內(nèi)外源性應力對間質(zhì)干細胞成軟骨分化的調(diào)控[J];國際口腔醫(yī)學雜志;2016年04期

9 張宇坤;楊述華;孫立;楊操;田洪濤;徐亮;;生長分化生長因子-5在誘導小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞軟骨分化中的作用[J];中華創(chuàng)傷雜志;2006年12期

10 陳俠甫;金旭紅;黃鄧高;邢勢;王和杰;卓澤銘;車家駒;;低強度脈沖超聲對人臍帶干細胞體外增殖和成軟骨分化的影響[J];中國康復醫(yī)學雜志;2019年05期

相關會議論文 前10條

1 劉天一;周廣東;魏嫻;陳付國;呂曉杰;劉霞;陳瑾君;崔磊;劉偉;曹誼林;;力學刺激促進骨髓基質(zhì)干細胞體外軟骨分化[A];第4屆中國美容與整形醫(yī)師大會論文匯編[C];2007年

2 鄭有華;張志光;蘇凱;匡世軍;;成纖維細胞生長因子促進人骨髓間充質(zhì)干細胞成骨和成軟骨分化的實驗研究[A];第八屆全國顳下頜關節(jié)病學及（牙合）學大會論文匯編[C];2011年

3 岑嘯;張美;龐欣;吳敬飚;余祥華;湯亞玲;梁新華;;轉(zhuǎn)錄因子Prrx1對人脂肪干細胞成骨、成軟骨分化的影響及機制初探[A];2018口腔病理年會暨第十二次全國口腔病理學術會議論文集[C];2018年

4 譚磊;孫大輝;;腺苷及腺苷A2B受體在沖擊波抑制人類骨髓間充質(zhì)干細胞向軟骨分化中的作用及機制研究[A];第十二屆全國生物力學學術會議暨第十四屆全國生物流變學學術會議會議論文摘要匯編[C];2018年

5 萬凌云;李娟;趙志河;唐舸;孫勇;;YAP/TAZ過表達對不同基質(zhì)硬度影響間充質(zhì)干細胞成軟骨分化過程的作用[A];中華口腔醫(yī)學會第九次全科口腔醫(yī)學學術會議論文匯編[C];2018年

6 房維;肖殷;龍星;;軟骨缺損模型體內(nèi)軟骨分化的實驗研究[A];第九次全國顳下頜關節(jié)病學及(牙合)學研討會論文匯編[C];2012年

7 韋孔昌;朱美靈;邊黎明;;用于軟骨修復的多功能自組裝囊泡的制備[A];2015年全國高分子學術論文報告會論文摘要集——主題F-生物醫(yī)用高分子[C];2015年

8 李娟;王軍;趙志河;;MAPK信號通路在大鼠BMSCs成軟骨分化過程中的力學轉(zhuǎn)導機制研究[A];第十一屆全國生物力學學術會議暨第十三屆全國生物流變學學術會議會議論文摘要匯編[C];2015年

9 黃俊武;葉菊花;張春梅;黃偉;吳陳歡;胡國鵬;周曉武;;HIF-2a在小鼠間質(zhì)干細胞C3H10T1/2成軟骨分化中表達抑制[A];中國中藥雜志2015/專集：基層醫(yī)療機構(gòu)從業(yè)人員科技論文寫作培訓會議論文集[C];2016年

10 齊勇建;李斌;陳廖斌;;TGFβRs去乙�；閷瞧べ|(zhì)激素編程IUGR子代軟骨分化不良及OA樣表型易感[A];2017年生殖毒理藥理學理論與技術及科技產(chǎn)品研發(fā)學術交流會論文集[C];2017年

相關博士學位論文 前10條

1 劉劍偉;碳點介導siTnfα調(diào)控炎癥促進間充質(zhì)干細胞成軟骨分化的研究[D];廣西醫(yī)科大學;2019年

2 蔣超;血清纖維黏連蛋白促晚期骨關節(jié)炎患者軟骨下松質(zhì)骨祖細胞軟骨分化[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2014年

3 唐仲文;骨不連細胞體外培養(yǎng)及壓應力刺激對其成軟骨分化影響的研究[D];中南大學;2014年

4 王亮;人骨髓間充質(zhì)干細胞成骨及成軟骨分化中長鏈非編碼RNA的初步研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2015年

5 劉姍姍;7，8-二羥基香豆素促進大鼠脂肪來源間充質(zhì)干細胞增殖及成軟骨分化的研究[D];吉林大學;2012年

6 曲峰;Wnt3a對骨髓間充質(zhì)干細胞成軟骨分化影響的研究[D];南開大學;2013年

7 白曉卉;ADAMTS-7和ADAMTS-12抑制軟骨分化的功能研究[D];山東大學;2009年

8 房維;軟骨調(diào)節(jié)素-1在顳下頜關節(jié)軟骨及軟骨分化中的表達[D];武漢大學;2010年

9 叢銳軍;滑膜間充質(zhì)干細胞向纖維軟骨分化的條件及分子機制研究[D];第二軍醫(yī)大學;2013年

10 王大偉;1、GEP蛋白在骨骼肌分化過程中的功能研究 2、ADAMTS-12抑制軟骨分化的功能研究[D];山東大學;2009年

相關碩士學位論文 前10條

1 馮頂麗;MiR-127-5p-mimic和MiR-99a-inhibitor協(xié)同促進脂肪干細胞成軟骨分化的相關研究[D];山西醫(yī)科大學;2019年

2 繆志康;蛇毒神經(jīng)生長因子調(diào)控自噬誘導BMSCs成軟骨分化的作用及其機制研究[D];廣西醫(yī)科大學;2018年

3 魏媛媛;KDM6A對牙周膜干細胞成軟骨分化中MiR-204和MiR-211表達的影響及意義[D];天津醫(yī)科大學;2018年

4 常崇斐;PPARδ激動劑對人關節(jié)液來源的間充質(zhì)干細胞成軟骨分化及抗炎效果的影響[D];廣州醫(yī)科大學;2018年

5 吳玉喜;共培養(yǎng)誘導間充質(zhì)干細胞成軟骨分化以及培養(yǎng)方式對軟骨細胞表型的影響[D];華東理工大學;2018年

6 馮江峰;Kartogenin通過調(diào)節(jié)SOX9促進小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞成軟骨分化的實驗研究[D];山西醫(yī)科大學;2018年

7 王志寬;兔骨髓間充質(zhì)干細胞與Buffy coat體外軟骨分化的比較分析[D];延邊大學;2017年

8 楊以萌;發(fā)散式?jīng)_擊波對骨髓間充質(zhì)干細胞體內(nèi)成軟骨分化影響[D];中國人民解放軍醫(yī)學院;2017年

9 楊丹聃;無血清條件培養(yǎng)基法誘導人胚胎干細胞成軟骨分化的研究[D];吉林大學;2015年

10 黃朋;兔脂肪干細胞的分離培養(yǎng)鑒定及成軟骨分化的實驗研究[D];華中科技大學;2012年

本文編號：2741319