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MiR-127-5p-mimic和MiR-99a-inhibitor協(xié)同促進(jìn)脂肪干細(xì)胞成軟骨分化的相關(guān)研究

發(fā)布時(shí)間:2020-07-04 16:36
【摘要】:目的:1.分離培養(yǎng)棕色脂肪干細(xì)胞(Brown Adipose-derived mesenchymal stem cells BADSCs)和白色脂肪干細(xì)胞(White Adipose-derived mesenchymal stem cells WADSCs),并對(duì)兩種細(xì)胞進(jìn)行鑒定及生長(zhǎng)動(dòng)力研究。2.比較BADSCs和WADSCs體外成脂、成骨及成軟骨能力,為組織工程種子細(xì)胞的選擇提供理論依據(jù)。3.分別研究不同miRNA在ADSCs成軟骨分化中的作用,以及不同miRNA在ADSCs成軟骨分化中的協(xié)同作用,并試圖探究其作用機(jī)制。方法:1.分離SD大鼠棕色及白色脂肪組織,得到BADSCs和WADSCs。倒置顯微鏡觀察兩種細(xì)胞的形態(tài)、細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)增殖能力、流式儀鑒定細(xì)胞表面抗原標(biāo)記物。2.將BADSCs和WADSCs進(jìn)行成脂、成骨和成軟骨誘導(dǎo)。兩種細(xì)胞成脂后進(jìn)行油紅-O染色,成骨后進(jìn)行堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase ALP)活性檢測(cè)及茜素紅染色,成軟骨后進(jìn)行阿辛藍(lán)染色。qRT-PCR進(jìn)一步檢測(cè)兩種細(xì)胞成脂、成骨、成軟骨相關(guān)基因的表達(dá)水平。3.通過qRT-PCR檢測(cè)ADSCs軟骨向分化過程中,miR-99a和miR-127-5p時(shí)間相關(guān)的表達(dá)趨勢(shì)。隨后將miR-99a-inhibitor和miR-127-5p-mimic通過lipofectamine2000遞送至ADSCs,遞送miR-99a-inhibitor的ADSCs指定為M組,遞送miR-127-5p-mimic的ADSCs指定為N組,遞送miR-99a-inhibitor和miR-127-5p-mimic的ADSCs指定為M+N組,沒有進(jìn)行處理的ADSCs充當(dāng)陰性對(duì)照(NC組)。24小時(shí)后通過qRT-PCR檢測(cè)ADSCs內(nèi)miR-99a和miR-127-5p的含量,并通過MTT法檢測(cè)四組細(xì)胞的增殖能力。4.四組ADSCs進(jìn)行成軟骨誘導(dǎo),qRT-PCR檢測(cè)軟骨標(biāo)志基因II型膠原蛋白(Type II collagen-A1 COL2A1)和聚集蛋白多糖(Aggrecan ACAN)mRNA的表達(dá)水平,Western Blot檢測(cè)COL2A1和ACAN蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。結(jié)果:1.分離培養(yǎng)BADSCs和WADSCs,細(xì)胞貼壁后,倒置顯微鏡觀察,二者形態(tài)類似,WADSCs胞體較BADSCs大;流式儀鑒定二者表面抗原標(biāo)記物,均符合間充質(zhì)干細(xì)胞的特征;細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)增殖能力表明WADSCs強(qiáng)于BADSCs。2.BADSCs和WADSCs都具有成脂分化能力。與BADSCs相比,WADSCs中脂滴形成相對(duì)較快且數(shù)量較多,相同時(shí)間點(diǎn)成脂標(biāo)志基因PPAR、C/EBPB表達(dá)也相對(duì)較高;BADSCs和WADSCs均可成骨向分化。成骨誘導(dǎo)后相同時(shí)間點(diǎn)BADSCs的ALP活性較大,且5周時(shí)茜素紅染色面積大于WADSCs。Runx2、OCN基因的表達(dá)也相對(duì)較高;BADSCs和WADSCs都具有成軟骨分化能力。兩種細(xì)胞切片的阿辛藍(lán)染色和COL2A1、ACAN基因的表達(dá)量并無明顯區(qū)別。3.MiR-99a-inhibitor和miR-127-5p-mimic通過lipofectamine2000遞送至ADSCs,24小時(shí)后qRT-PCR檢測(cè)到miR-99a的量低于NC組和miR-127-5p的量高于NC組;通過MTT實(shí)驗(yàn)測(cè)得四組ADSCs的增殖能力無明顯差異。4.四組細(xì)胞用成軟骨培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)后,檢測(cè)到M組和N組COL2A1、ACAN基因和蛋白水平的表達(dá)量高于NC組,M+N組COL2A1、ACAN基因和蛋白水平的表達(dá)量高于M組和N組。結(jié)論:1.本實(shí)驗(yàn)方法可較為快速的提取BADSCs和WADSCs并進(jìn)行純化。提取的BADSC和WADSCs都具有較強(qiáng)的增殖能力,可擴(kuò)增為大量細(xì)胞,用于實(shí)驗(yàn)研究。2.BADSCs和WADSCs均具有成脂分化能力,但WADSCs成脂分化能力較強(qiáng);BADSCs和WADSCs均具有成骨分化能力,但BADSCs成骨分化能力較強(qiáng);BADSCs和WADSCs均具有成軟骨分化能力,且二者成軟骨分化能力無明顯差異。3.MiR-99a和miR-127-5p在ADSCs的軟骨分化中均可起到一定的調(diào)節(jié)作用,miR-99a在ADSCs的軟骨分化中可起到抑制即負(fù)調(diào)節(jié)作用,miR-127-5p在ADSCs的軟骨分化中可起到促進(jìn)即正調(diào)節(jié)作用。MiR-99a-inhibitor可削弱miR-99a的負(fù)調(diào)節(jié)作用與正調(diào)節(jié)因子miR-127-5p協(xié)同促進(jìn)ADSCs的軟骨分化。
【學(xué)位授予單位】:山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】:碩士
【學(xué)位授予年份】:2019
【分類號(hào)】:R78
【圖文】:

棕色脂肪組織,脂肪組織,大鼠


(3) 在超凈臺(tái)內(nèi)分離肩胛骨下和腹股溝脂肪組織(圖 1-1)。將獲取的脂肪組織浸泡在預(yù)冷的 PBS 里;(4) 去除血管和筋膜組織,PBS 沖洗 3-4 次;(5) 分離成體積大小為 1mm3的組織小塊;(6) 將剪碎的脂肪組織小塊移入含有玻璃球、磁力攪拌器轉(zhuǎn)子、酶消化液(由體積比為 4:4:1:1 的 HG—DMEM、0.25%EDTA 一胰酶消化液、Dispase、Ⅳ膠原酶配制)的玻璃瓶;(7) 磁力攪拌器低轉(zhuǎn)速下,孵箱中旋轉(zhuǎn)消化 30-40min 左右;終止消化后,過濾懸液;(8) 以 1000rpm,5min 離心濾液,收集細(xì)胞,再加入 α- MEM(含 10% FBS)重懸,計(jì)數(shù);(9) 接種,孵箱中常規(guī)培養(yǎng);(10) 24h 后換液,以后隔 2 天換 1 次培養(yǎng)基,細(xì)胞長(zhǎng)滿 80%左右,消化傳代培養(yǎng)。

形態(tài)學(xué)性狀


(1) 從第 1 代開始,將 ADSCs 消化,重懸,計(jì)數(shù);(2) 接種于 6 孔板,密度為 2.5×105個(gè)/孔。培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 3d 后,第 2 代細(xì)胞胰酶消化后使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),每個(gè)樣本取 3 個(gè)孔,計(jì)算均值;(3) 計(jì)數(shù)并離心后重懸細(xì)胞,以相同密度再次接種于 6 孔板為 P3 代,相同方法計(jì)數(shù)并記錄;(4) P4~P9 代細(xì)胞利用上述方法依次進(jìn)行計(jì)數(shù)并記錄。1.3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用 SPSS18.0 軟件分析數(shù)據(jù),結(jié)果用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表達(dá)數(shù)據(jù);進(jìn)行單因素方差分析,或 t 檢驗(yàn)。以雙側(cè) P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2 結(jié) 果2.1 BADSCs 和 WADSCs 的形態(tài)學(xué)觀察

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本文編號(hào):2741319

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