【摘要】：成牙本質(zhì)細(xì)胞分化是牙髓組織自身?yè)p傷修復(fù)過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié),也是牙胚發(fā)育的重要階段,這一過(guò)程受多種因子的調(diào)控,尋找誘導(dǎo)成牙本質(zhì)細(xì)胞分化的因子并闡明其誘導(dǎo)機(jī)制,一直是牙髓生物學(xué)的研究熱點(diǎn),也是認(rèn)識(shí)牙髓損傷修復(fù)過(guò)程、形成治療新靶點(diǎn)的關(guān)鍵。目前已發(fā)現(xiàn)多種細(xì)胞外基質(zhì)分子及其受體、生長(zhǎng)因子及受體、同源異形盒基因、原癌基因及轉(zhuǎn)錄因子、維甲酸及其受體、細(xì)胞粘附分子等參與成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化,其中,生長(zhǎng)因子及其受體參與細(xì)胞調(diào)控、分化的研究始終是生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)。 釉原蛋白(Amelogenin,AMG)是成釉細(xì)胞分泌的一組同源性的低分子量(20～30KD)的疏水蛋白,富含脯氨酸、谷氨酰胺和組胺酸,是釉基質(zhì)蛋白的主要成分,約占90%,它在牙齒發(fā)育的各個(gè)階段均有表達(dá),以往對(duì)于釉原蛋白的研究主要集中于其在牙胚發(fā)育中的表達(dá)、對(duì)釉質(zhì)發(fā)育形成的作用及其在牙周組織再生中的作用。2005年Tompkins等報(bào)道純化的大鼠釉原蛋白可促進(jìn)體外培養(yǎng)的小鼠牙胚中的成牙本質(zhì)細(xì)胞的成熟,這提示釉原蛋白可能能夠促進(jìn)成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化成熟。 本研究旨在觀察小鼠釉原蛋白對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠成牙本質(zhì)細(xì)胞系MDPC-23分化的影響及其機(jī)制,研究釉原蛋白在成牙本質(zhì)細(xì)胞分化過(guò)程中,對(duì)細(xì)胞存活,增殖和分化的影響,進(jìn)一步研究其對(duì)MAPKs各通路蛋白磷酸化的影響,并應(yīng)用MAPKs抑制劑和釉原蛋白聯(lián)合作用,特異性阻斷各MAPKs通路,觀察釉原蛋白誘導(dǎo)成牙本質(zhì)細(xì)胞分化的影響。為研究牙齒損傷修復(fù)過(guò)程中釉原蛋白參與成牙本質(zhì)細(xì)胞分化過(guò)程的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下: 1.首先我們從MDPC-23細(xì)胞克隆到了小鼠的釉原蛋白基因,全長(zhǎng)591bp,Genbank登錄號(hào)為NM 009666,同時(shí)設(shè)計(jì)了干涉釉原蛋白的序列,在此基礎(chǔ)上,構(gòu)建了能高效過(guò)表達(dá)釉原蛋白和干涉釉原蛋白的重組腺病毒(Ad-AMG、Ad-shAMG)及對(duì)照腺病毒Ad-EGFP載體,進(jìn)行病毒擴(kuò)增和滴度測(cè)定,并感染MDPC-23細(xì)胞檢測(cè)其表達(dá)及干涉效果,結(jié)果表明:構(gòu)建的腺病毒載體能夠正確地表達(dá)釉原蛋白或干涉其表達(dá)。 2.腺病毒感染MDPC-23細(xì)胞后光鏡觀察表明,過(guò)表達(dá)釉原蛋白導(dǎo)致MDPC-23細(xì)胞形成較長(zhǎng)的突起,胞體相對(duì)縮小,表明細(xì)胞分裂活動(dòng)變得旺盛,干涉釉原蛋白對(duì)MDPC-23細(xì)胞形態(tài)沒(méi)有明顯影響,通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)釉原蛋白抑制了MDPC-23細(xì)胞的生長(zhǎng)速度,而干涉釉原蛋白則促進(jìn)了MDPC-23細(xì)胞的增殖,流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明過(guò)表達(dá)釉原蛋白導(dǎo)致MDPC-23細(xì)胞的G1期細(xì)胞比例升高,S期比例下降,而干涉釉原蛋白導(dǎo)致MDPC-23細(xì)胞的G1期比例降低,S期升高。堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase ,ALP)是成牙本質(zhì)細(xì)胞分化的一個(gè)重要指標(biāo),因此,檢測(cè)ALP活性的變化可以反應(yīng)細(xì)胞的分化狀態(tài),通過(guò)ALP活性和礦化結(jié)節(jié)形成檢測(cè)發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)釉原蛋白后,MDPC-23細(xì)胞的ALP活性顯著增高,礦化能力增強(qiáng)。RT-PCR結(jié)果表明,過(guò)表達(dá)釉原蛋白后,成牙本質(zhì)細(xì)胞分化標(biāo)志物DMP-1和DSPP的表達(dá)升高。相反,干涉釉原蛋白導(dǎo)致MDPC-23細(xì)胞的ALP活性降低,礦化能力減弱,DMP-1和DSPP的表達(dá)下降,Western結(jié)果表明,釉原蛋白促進(jìn)MDPC-23細(xì)胞分化主要是通過(guò)ERK1/2 and p38通路起作用的。 3.為研究釉原蛋白誘導(dǎo)MDPC-23細(xì)胞分化的分子機(jī)制,我們采用了基因表達(dá)譜芯片篩選MDPC-23細(xì)胞分化的差異基因,如果實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組熒光染料的cy5/cy3比值在2.0以上,就判斷為上調(diào)基因;如果實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組熒光染料的cy5/cy3比值在0.5以下,就判斷為下調(diào)基因,依此標(biāo)準(zhǔn)共獲得上調(diào)與下調(diào)的基因數(shù)目分別為1140和487。其中,有些變化的基因如骨形態(tài)發(fā)生蛋白7(bone morphogenetic protein7, BMP-7)、神經(jīng)細(xì)胞粘附分子(Neural cell adhesion molecules, NCAMs)、細(xì)胞周期依賴(lài)蛋白激酶2(cyclin-dependent kinase 2, Cdk2)等都可能與釉原蛋白誘導(dǎo)的MDPC-23細(xì)胞分化相關(guān),下一步擬用定量PCR的方法驗(yàn)證差異基因的變化情況,并進(jìn)行相應(yīng)的功能學(xué)實(shí)驗(yàn),綜上所述,我們的結(jié)果提示釉原蛋白在體外能夠促進(jìn)成牙本質(zhì)細(xì)胞系MDPC-23的分化成熟,其機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。 研究結(jié)論: 1.克隆到了小鼠的釉原蛋白基因,全長(zhǎng)591bp,構(gòu)建了能高效過(guò)表達(dá)釉原蛋白和干涉釉原蛋白的重組腺病毒(Ad-AMG、Ad-shAMG)及對(duì)照腺病毒Ad-EGFP載體,構(gòu)建的腺病毒載體能夠正確地表達(dá)釉原蛋白或干涉其表達(dá)。 2.過(guò)表達(dá)釉原蛋白導(dǎo)致MDPC-23細(xì)胞形成較長(zhǎng)的突起,胞體相對(duì)縮小,表明細(xì)胞分裂活動(dòng)變得旺盛,干涉釉原蛋白對(duì)MDPC-23細(xì)胞形態(tài)沒(méi)有明顯影響。過(guò)表達(dá)釉原蛋白抑制了MDPC-23細(xì)胞的生長(zhǎng)速度,而干涉釉原蛋白則促進(jìn)了MDPC-23細(xì)胞的增殖。過(guò)表達(dá)釉原蛋白導(dǎo)致MDPC-23細(xì)胞的G1期細(xì)胞比例升高,S期比例下降,而干涉釉原蛋白導(dǎo)致MDPC-23細(xì)胞的G1期比例降低,S期升高。過(guò)表達(dá)釉原蛋白后,MDPC-23細(xì)胞的ALP活性顯著增高,礦化能力增強(qiáng),成牙本質(zhì)細(xì)胞分化標(biāo)志物DMP-1和DSPP的表達(dá)升高,干涉釉原蛋白后結(jié)果相反,釉原蛋白可使ERK1/2和p38的磷酸化增強(qiáng),對(duì)JNK的磷酸化沒(méi)有影響,采用通路抑制劑U0126和SB203580可顯著抑制ERK1/2和p38的磷酸化,同時(shí)可阻斷釉原蛋白誘導(dǎo)的MDPC-23細(xì)胞分化。 3.采用基因表達(dá)譜芯片篩選MDPC-23細(xì)胞分化的差異基因,共獲得上調(diào)與下調(diào)的基因數(shù)目分別為1140和487,其中,有些變化的基因如BMP-7、NCAMs、Cdk2等都可能與釉原蛋白誘導(dǎo)的MDPC-23細(xì)胞分化相關(guān),下一步擬用定量PCR的方法驗(yàn)證差異基因的變化情況,并進(jìn)行相應(yīng)的功能學(xué)實(shí)驗(yàn)。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類(lèi)號(hào)】：R780.2
【圖文】：

圖 1. 小鼠釉原蛋白基因的克隆T-AMG 載體的酶切鑒定和測(cè)序 PCR 產(chǎn)物，與 pMD18-T 載體進(jìn)行連接，連接后電泳結(jié)果來(lái)看(圖 2)，8 個(gè)克隆中，除第 5 個(gè)克隆有插入片斷，選取酶切正確克隆進(jìn)行測(cè)序，送北圖 3)：

圖 1. 小鼠釉原蛋白基因的克隆2. pMD18-T-AMG 載體的酶切鑒定和測(cè)序膠回收上述 PCR 產(chǎn)物，與 pMD18-T 載體進(jìn)行連接，連接后進(jìn)行 Bgl II 和切鑒定，從電泳結(jié)果來(lái)看(圖 2)，8 個(gè)克隆中，除第 5 個(gè)克隆中沒(méi)有插入片斷7 個(gè)克隆均有插入片斷，選取酶切正確克隆進(jìn)行測(cè)序，送北京奧科公司進(jìn)行結(jié)果如下(圖 3)：

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2737777