發(fā)布時(shí)間：2020-06-30 09:54

【摘要】： 目的：觀察外源性目的基因pacA-ctxB、pacP-ctxB及目的蛋白PAcA/CTB、PAcP/CTB在轉(zhuǎn)基因番茄和非轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá),轉(zhuǎn)基因番茄免疫動(dòng)物后的毒性作用,初步分析轉(zhuǎn)基因番茄防齲疫苗的生態(tài)安全性和對(duì)動(dòng)物的安全性。 方法：本研究包括三個(gè)部分 實(shí)驗(yàn)一轉(zhuǎn)基因番茄中外源目的基因和目的蛋白表達(dá)的檢測(cè) 提取轉(zhuǎn)基因番茄總DNA, PCR篩選含外源基因pacA-ctxB、pacP-ctxB的轉(zhuǎn)基因番茄植株；通過(guò)Western blot檢測(cè)外源蛋白的表達(dá)情況；提取番茄果實(shí)總蛋白,用BCA試劑盒測(cè)定番茄果實(shí)總蛋白含量,并用ELISA法對(duì)外源目的蛋白含量進(jìn)行測(cè)定。 實(shí)驗(yàn)二轉(zhuǎn)基因番茄的生態(tài)安全性檢查 1、外源基因隨花粉漂移的檢測(cè)：田間種植轉(zhuǎn)基因番茄,距轉(zhuǎn)基因植株的邊緣0.5m、1m、3m、10m處種植非轉(zhuǎn)基因?qū)φ辗炎鳛榛蚱频氖荏w,開(kāi)花期自由授粉,結(jié)果期在距離轉(zhuǎn)基因番茄植株邊緣0.5m、1m、3m、10m處,隨機(jī)分別收取10株番茄果實(shí),采集種子實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng),幼苗期采集葉片進(jìn)行PCR檢測(cè)。 2、轉(zhuǎn)基因植株根際土壤的檢測(cè)：在轉(zhuǎn)基因番茄植株根部的東、南、西、北方向各取一份土壤樣本,提取土壤總DNA進(jìn)行外源基因根系漂移的檢測(cè)。 3、轉(zhuǎn)基因番茄目的基因拷貝數(shù)的檢測(cè)：用本課題組前期構(gòu)建的重組質(zhì)粒pEAC10、pEPC10作為標(biāo)準(zhǔn)品,SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR法對(duì)含外源基因pacA-ctxB、pacP-ctxB的轉(zhuǎn)基因番茄植株的總基因組樣本重復(fù)檢測(cè),取平均值作為目的基因拷貝數(shù)。 實(shí)驗(yàn)三轉(zhuǎn)基因番茄的動(dòng)物安全性檢查 1、對(duì)大鼠的急性毒性實(shí)驗(yàn) (1)動(dòng)物的選擇、分組：wistar大鼠24只,雌雄各半,隨機(jī)分為3組。A組：用含PAcA/CTB蛋白的轉(zhuǎn)基因番茄汁免疫；B組：用含PAcP/CTB蛋白的轉(zhuǎn)基因番茄汁免疫組；C組(對(duì)照組)：用非轉(zhuǎn)基因的番茄汁免疫。 (2)免疫方案：1日3次,按20g/kg(體重)劑量灌胃。 (3)觀察指標(biāo)：①實(shí)驗(yàn)期間每2天測(cè)量動(dòng)物體重。②記錄毒性反應(yīng)癥狀出現(xiàn)和消失的時(shí)間,死亡時(shí)間。③第7天處死全部動(dòng)物,取心、肝、腎、脾、胸腺進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。 2、對(duì)大鼠的亞慢性毒性實(shí)驗(yàn) (1)動(dòng)物的選擇、分組：wistar大鼠72只,雌雄各半,隨機(jī)分為6組。 實(shí)驗(yàn)組A1：用含PAcA/CTB蛋白的轉(zhuǎn)基因番茄汁以20g/kg(體重)劑量免疫； 實(shí)驗(yàn)組A2：用含PAcA/CTB蛋白的轉(zhuǎn)基因番茄汁以10g/kg(體重)劑量免疫； 實(shí)驗(yàn)組B1：用含PAcP/CTB蛋白的轉(zhuǎn)基因番茄汁以20g/kg(體重)劑量免疫； 實(shí)驗(yàn)組B2：用含PAcP/CTB蛋白的轉(zhuǎn)基因番茄汁以10g/kg(體重)劑量免疫； 實(shí)驗(yàn)組C1：用非轉(zhuǎn)基因的番茄汁以20g/kg(體重)劑量免疫； 實(shí)驗(yàn)組C2：用非轉(zhuǎn)基因的番茄汁以10g/kg(體重)劑量免疫； (2)免疫方案：連續(xù)灌胃30天每天定時(shí)灌胃。 (3)觀察指標(biāo)：①實(shí)驗(yàn)期間每天測(cè)量動(dòng)物體重。②嚴(yán)密觀察動(dòng)物行為活動(dòng)、外觀體征。③灌胃第30天后進(jìn)行血液學(xué)、血生化和尿液檢查。④取其心、肝、脾、肺、腎稱重,計(jì)算臟器系數(shù)。⑤心、肝、脾、肺、腎進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。 3、致突變實(shí)驗(yàn)的檢查 3.1骨髓細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)： (1)動(dòng)物的選擇、分組：昆明小鼠42只,雌雄各半,隨機(jī)分為7組。 實(shí)驗(yàn)組A1：用含PAcA/CTB蛋白的轉(zhuǎn)基因番茄汁以5g/kg(體重)劑量免疫； 實(shí)驗(yàn)組A2：用含PAcA/CTB蛋白的轉(zhuǎn)基因番茄汁以2g/kg(體重)劑量免疫； 實(shí)驗(yàn)組B1：用含PAcP/CTB蛋白的轉(zhuǎn)基因番茄汁以5g/kg(體重)劑量免疫； 實(shí)驗(yàn)組B2：用含PAcP/CTB蛋白的轉(zhuǎn)基因番茄汁以2g/kg(體重)劑量免疫； 陰性對(duì)照組C1：用非轉(zhuǎn)基因的番茄汁以5g/kg(體重)劑量免疫； 陰性對(duì)照組C2：用非轉(zhuǎn)基因的番茄汁以2g/kg(體重)劑量免疫； 陽(yáng)性對(duì)照組D：用100mg/(kg*d)環(huán)磷酰胺注射； (2)免疫方案：實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組連續(xù)灌胃4天,陽(yáng)性對(duì)照組環(huán)磷酰胺腹腔注射,連續(xù)4天。第5天處死動(dòng)物。 (3)觀察指標(biāo)：制備小鼠骨髓片,顯微鏡下計(jì)數(shù)含微核的嗜多染紅細(xì)胞數(shù),取其平均值。計(jì)算微核率。 3.2精子畸形實(shí)驗(yàn)： (1)動(dòng)物的選擇、分組：雄性昆明小鼠42只,隨機(jī)分為7組,除陽(yáng)性對(duì)照組D用20mg/(kg*d)環(huán)磷酰胺注射外,其他分組同骨髓細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)。 (2)免疫方案：實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組連續(xù)灌胃5天,陽(yáng)性對(duì)照組環(huán)磷酰胺腹腔注射,連續(xù)5天。首次給予受試物后的第35天處死動(dòng)物。 (3)觀察指標(biāo)：制備小鼠精子片,顯微鏡下計(jì)數(shù)畸形的精子,計(jì)算精子畸形率。 4、一代生殖毒性實(shí)驗(yàn) (1)動(dòng)物的選擇、分組：SD大鼠60只,雌雄各半,隨機(jī)分為3組。A組：用含PAcA/CTB蛋白的轉(zhuǎn)基因番茄汁免疫；B組：用含PAcP/CTB蛋白的轉(zhuǎn)基因番茄汁免疫；C組(對(duì)照組)：用非轉(zhuǎn)基因的番茄汁免疫。 (2)免疫方案：以1g/kg(體重)劑量,雄鼠持續(xù)灌胃8周后,雌鼠開(kāi)始灌胃,持續(xù)2周后,雌雄大鼠按1：1同籠交配,交配期間繼續(xù)灌胃,3周后將雄性處死,雌鼠繼續(xù)灌胃直至子代出生后3周斷乳為止。 (3)觀察指標(biāo)：①每天觀察大鼠的一般狀況,每周稱重。②每一妊娠動(dòng)物在分娩后檢查幼仔數(shù)、死產(chǎn)仔數(shù)、活產(chǎn)仔數(shù)。記錄幼仔出生時(shí)及生后1、4、7、21天的體重、身長(zhǎng)和尾長(zhǎng)、并計(jì)數(shù)活、死幼仔數(shù)。③計(jì)算親代大鼠的受孕率、正常分娩率,以及幼鼠的出生存活率和哺乳成活率。④觀察胎鼠的骨骼軟骨。⑤所有動(dòng)物處死時(shí)進(jìn)行肉眼病理學(xué)檢查,必要時(shí)進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。 結(jié)果： 1、含pacA-CtxB和pacP-ctxB的轉(zhuǎn)基因番茄總基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè),得到大小約為450bp和506bp的條帶,與陽(yáng)性對(duì)照一致。Western Blot檢測(cè)轉(zhuǎn)基因番茄蛋白提取樣本在PVDF膜上約60KD處出現(xiàn)特異性條帶。BCA法及ELISA法測(cè)得含PAcA/CTB轉(zhuǎn)基因番茄外源目的蛋白約占植物總蛋白含量的0.101%,含PAcP/CTB轉(zhuǎn)基因番茄外源目的蛋白約占植物總蛋白含量的0.068%。 2、①距離轉(zhuǎn)基因番茄0.5m處的17株非轉(zhuǎn)基因番茄第二代植株進(jìn)行PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)有外源目的基因pacA-ctxB、pacP-ctxB；②分別對(duì)10株含pacA-ctxB、pacP-ctxB轉(zhuǎn)基因番茄的東、南、西、北四個(gè)方向根際土壤總DNA中未擴(kuò)增出相應(yīng)的目的片段；③本課題組培育的含pacA-ctxB轉(zhuǎn)基因番茄植株外源基因的拷貝數(shù)為1.3,含pacP-ctxB轉(zhuǎn)基因番茄植株外源基因的拷貝數(shù)為3.2。 3、①急性毒性實(shí)驗(yàn)中大鼠均未見(jiàn)毒性癥狀,實(shí)驗(yàn)組大鼠各臟器與陰性對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,急性毒性半數(shù)致死量LD5020g/kg；②亞慢性毒性實(shí)驗(yàn)中雌雄大鼠均未見(jiàn)毒性癥狀,通過(guò)血液學(xué)和生化、臟器系數(shù)和組織病理學(xué)檢查,實(shí)驗(yàn)組大鼠與陰性對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；③骨髓細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)中4個(gè)轉(zhuǎn)基因番茄實(shí)驗(yàn)組小鼠骨髓細(xì)胞微核發(fā)生率與陰性對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)：而陽(yáng)性對(duì)照組與其他各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；精子畸形實(shí)驗(yàn)中4個(gè)轉(zhuǎn)基因番茄實(shí)驗(yàn)組的受試小鼠的精子畸形率與陰性對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；而陽(yáng)性對(duì)照組與其他各組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；④一代生殖毒性實(shí)驗(yàn)中,實(shí)驗(yàn)期間各組大鼠均未出現(xiàn)毒性癥狀,體重變化比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；各組仔鼠的平均體重、身長(zhǎng)、尾長(zhǎng)經(jīng)兩兩比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；實(shí)驗(yàn)組的受孕率、正常分娩率、幼仔出生存活率、幼仔哺乳成活率各指標(biāo)與對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；實(shí)驗(yàn)組胎仔脊椎骨、胸骨、肋骨、四肢骨等檢查與對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；經(jīng)肉眼觀察,各組動(dòng)物心、肝、脾、肺、腎、子宮、卵巢、睪丸、附睪的大小、顏色、外形、軟硬度及切面結(jié)構(gòu)等均未見(jiàn)明顯異常變化。 結(jié)論： 1、獲得了含有pacA-ctxB和pacP-ctxB目的基因的轉(zhuǎn)基因番茄植株,并且轉(zhuǎn)基因番茄子代植株能有效的表達(dá)外源蛋白。 2、外源基因pacA-ctxB、pacP-ctxB在田間可通過(guò)花粉造成基因漂移,但外源基因未通過(guò)根系分泌物漂移到轉(zhuǎn)基因植株根際土壤中。本課題組構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因番茄植株屬低拷貝的轉(zhuǎn)基因植物,具有較好的穩(wěn)定性。 3、本實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)基因番茄防齲疫苗沒(méi)有急性,亞慢性毒性作用,也不會(huì)引起致畸突變反應(yīng)和明顯的生殖毒性作用,初步證實(shí)所用的轉(zhuǎn)基因番茄防齲疫苗是安全無(wú)毒的。
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R781.1
【圖文】：

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【引證文獻(xiàn)】

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1 白國(guó)輝;田源;白朋元;韓琪;劉建國(guó);;轉(zhuǎn)基因番茄中外源目的基因檢測(cè)方法的篩選[J];遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2011年05期

2 錢昱霏;劉建國(guó);白國(guó)輝;管曉燕;韓琪;白朋元;;轉(zhuǎn)基因番茄中外源目的蛋白提取液的篩選[J];遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2013年02期

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1 韓琪;防齲用轉(zhuǎn)基因番茄中外源目的蛋白表達(dá)穩(wěn)定性研究[D];遵義醫(yī)學(xué)院;2011年

本文編號(hào)：2735182