發(fā)布時(shí)間：2020-06-27 10:01

【摘要】：背景microRNAs(miRNAs)是小的非編碼RNA,長(zhǎng)度約20~22bp,由基因組轉(zhuǎn)錄,通過(guò)和靶基因mRNA堿基配對(duì),引導(dǎo)沉默復(fù)合體(RISC)降解mRNA或抑制mRNA的翻譯,從而在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控蛋白表達(dá)。作為機(jī)體內(nèi)源性RNA,同時(shí)作為可對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行微調(diào)的分子,其可能參與了生物體的生長(zhǎng)、發(fā)育、衰老及死亡的調(diào)控,近年來(lái)其在細(xì)胞增殖及分化中的意義引起廣泛關(guān)注。miRNA在多種細(xì)胞中均有表達(dá),它通過(guò)負(fù)向調(diào)節(jié)細(xì)胞中某些關(guān)鍵基因的表達(dá),對(duì)細(xì)胞的分化起調(diào)控作用[1.2.3]。 牙髓組織在牙齒的營(yíng)養(yǎng)代謝、感覺(jué)、修復(fù)等生理功能方面發(fā)揮著重要的作用,深入研究牙髓,有助于我們了解牙髓細(xì)胞的分化、牙髓鈣化、牙本質(zhì)形成以及相關(guān)的調(diào)節(jié)因素。牙髓細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)可向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化并形成牙本質(zhì)樣結(jié)構(gòu),預(yù)示了其在牙本質(zhì)再生中作為種子細(xì)胞的應(yīng)用前景。 目的通過(guò)檢測(cè)牙髓細(xì)胞及其誘導(dǎo)分化的成牙本質(zhì)細(xì)胞中miRNA基因的表達(dá)譜,篩選出誘導(dǎo)分化前后細(xì)胞表達(dá)的差異性miRNAs,并預(yù)測(cè)其可能靶基因,尋找可能的人牙髓細(xì)胞成牙本質(zhì)分化特異性的miRNAs,并進(jìn)行驗(yàn)證,為進(jìn)一步探討miRNAs對(duì)HDPCs生物學(xué)功能的調(diào)控作用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 材料與方法(1)采用酶消化法+組織塊法分離培養(yǎng)人牙髓細(xì)胞,通過(guò)觀察原代及傳代HDPCs的形態(tài)特點(diǎn),免疫化學(xué)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物,對(duì)人牙髓細(xì)胞進(jìn)行鑒定;(2)采用地塞米松、b甘油磷酸鈉和維生素C聯(lián)合誘導(dǎo)HDPCs向成牙本質(zhì)細(xì)胞方向分化,檢測(cè)其堿性磷酸酶活性;(3)利用miRNA基因芯片技術(shù),檢測(cè)了人牙髓細(xì)胞及其誘導(dǎo)分化的成牙本質(zhì)細(xì)胞中miRNAs的表達(dá)譜,分析并篩選在HDPCs分化過(guò)程中差異表達(dá)的miRNA,并通過(guò)miRGen數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)其靶基因;(4)采用半定量RT-PCR的方法,對(duì)miRNA基因芯片篩選出的人DPCs及其誘導(dǎo)分化的成牙本質(zhì)細(xì)胞的差異miRNA進(jìn)行驗(yàn)證。 結(jié)果(1)經(jīng)酶消化法+組織塊法聯(lián)合培養(yǎng)所得的細(xì)胞,細(xì)胞表型免疫組化鑒定:波形蛋白、I型膠原表達(dá)陽(yáng)性。(2)牙髓細(xì)胞在含地塞米松、?-甘油磷酸鈉和維生素C的條件培養(yǎng)基中可誘導(dǎo)分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞,形成鈣化結(jié)節(jié),堿性磷酸酶活性檢測(cè)升高,鈣化結(jié)節(jié)Von Kossa染色陽(yáng)性表達(dá)。(3)利用基因芯片檢測(cè)了人DPCs及其誘導(dǎo)分化的成牙本質(zhì)細(xì)胞miRNAs的表達(dá)譜,篩選了差異表達(dá)的miRNAs,礦化誘導(dǎo)的HDPC較未誘導(dǎo)HDPC的表達(dá)譜比較,有72種miRNA發(fā)生1.5倍以上表達(dá)上調(diào),61種miRNA發(fā)生1.5倍以上表達(dá)下調(diào)。(4)對(duì)篩選出的差異表達(dá)miRNAs通過(guò)miRNA靶標(biāo)預(yù)測(cè)工具分析發(fā)現(xiàn),帶有靶標(biāo)基因的miRNA有35個(gè),35個(gè)miRNA的靶標(biāo)基因總和1327個(gè),miRNA和靶標(biāo)基因關(guān)系對(duì)總共2158個(gè)。(5)選擇hsa-miR-150用半定量RT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果與芯片結(jié)果一致。 結(jié)論(1)用組織塊酶消化法可從人牙髓中分離得到人牙髓細(xì)胞,并可在體外培養(yǎng)將其誘導(dǎo)分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞。(2)在人牙髓細(xì)胞及其誘導(dǎo)分化的成牙本質(zhì)細(xì)胞中均存在大量的miRNAs。(3)在人牙髓細(xì)胞及其誘導(dǎo)分化的成牙本質(zhì)細(xì)胞中存在差異表達(dá)的miRNAs,它們可能對(duì)牙髓細(xì)胞的成牙本質(zhì)分化起著重要的調(diào)控作用,即存在所謂的特異性miRNA.
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類(lèi)號(hào)】：R781.3
【圖文】：

系對(duì)。構(gòu)建人所有的 miRNA 和它們調(diào)控的靶，取 4 個(gè)流行的 miRNA 靶標(biāo)預(yù)測(cè)工具中的任意因存在靶標(biāo)關(guān)系。針對(duì)每個(gè)GO和KEGG Pathw功能集中的數(shù)目，以及 136 個(gè) miRNA 靶標(biāo)基因子表， 計(jì)算富積得分，該富積得分就是比值比檢驗(yàn)計(jì)算統(tǒng)計(jì)上顯著性程度 P 值，通過(guò) BH（B來(lái)降低假陽(yáng)性。組和未誘導(dǎo)組樣品中 hsa-miR-210 RT-PCR 產(chǎn)物 4-1），hsa-miR-210 在誘導(dǎo)前后均有表達(dá)，但表誘導(dǎo)分化組，說(shuō)明 hsa-miR-210 在成牙本質(zhì)細(xì)胞

通過(guò) miRNA 靶標(biāo)預(yù)測(cè)工具分析牙髓細(xì)胞組和礦化誘導(dǎo)成牙本質(zhì)細(xì)胞組 1個(gè)表達(dá)有顯著性差異的 miRNA， 發(fā)現(xiàn)帶有靶標(biāo)基因的 miRNA 有 35 個(gè)，35miRNA 的靶標(biāo)基因總和 1327 個(gè)，miRNA 和靶標(biāo)基因關(guān)系對(duì)總共 2158 個(gè)，針每個(gè) GO 和 KEGG Pathway 計(jì)算 35 個(gè) miRNA 靶標(biāo)基因在該功能集中的數(shù)目，到差異 miRNA 的靶標(biāo)基因體現(xiàn)的功能，主要集中在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞增殖，轉(zhuǎn)調(diào)控等方面（圖 4-2A、B、C、D）。A B3.2 差異表達(dá) miRNA 靶基因的預(yù)測(cè)及功能富積分析結(jié)果

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2731678