【摘要】：背景microRNAs(miRNAs)是小的非編碼RNA,長度約20~22bp,由基因組轉錄,通過和靶基因mRNA堿基配對,引導沉默復合體(RISC)降解mRNA或抑制mRNA的翻譯,從而在轉錄水平調控蛋白表達。作為機體內源性RNA,同時作為可對基因表達進行微調的分子,其可能參與了生物體的生長、發(fā)育、衰老及死亡的調控,近年來其在細胞增殖及分化中的意義引起廣泛關注。miRNA在多種細胞中均有表達,它通過負向調節(jié)細胞中某些關鍵基因的表達,對細胞的分化起調控作用[1.2.3]。 牙髓組織在牙齒的營養(yǎng)代謝、感覺、修復等生理功能方面發(fā)揮著重要的作用,深入研究牙髓,有助于我們了解牙髓細胞的分化、牙髓鈣化、牙本質形成以及相關的調節(jié)因素。牙髓細胞經(jīng)誘導可向成牙本質細胞分化并形成牙本質樣結構,預示了其在牙本質再生中作為種子細胞的應用前景。 目的通過檢測牙髓細胞及其誘導分化的成牙本質細胞中miRNA基因的表達譜,篩選出誘導分化前后細胞表達的差異性miRNAs,并預測其可能靶基因,尋找可能的人牙髓細胞成牙本質分化特異性的miRNAs,并進行驗證,為進一步探討miRNAs對HDPCs生物學功能的調控作用提供實驗基礎。 材料與方法(1)采用酶消化法+組織塊法分離培養(yǎng)人牙髓細胞,通過觀察原代及傳代HDPCs的形態(tài)特點,免疫化學檢測細胞表面標志物,對人牙髓細胞進行鑒定;(2)采用地塞米松、b甘油磷酸鈉和維生素C聯(lián)合誘導HDPCs向成牙本質細胞方向分化,檢測其堿性磷酸酶活性;(3)利用miRNA基因芯片技術,檢測了人牙髓細胞及其誘導分化的成牙本質細胞中miRNAs的表達譜,分析并篩選在HDPCs分化過程中差異表達的miRNA,并通過miRGen數(shù)據(jù)庫預測其靶基因;(4)采用半定量RT-PCR的方法,對miRNA基因芯片篩選出的人DPCs及其誘導分化的成牙本質細胞的差異miRNA進行驗證。 結果(1)經(jīng)酶消化法+組織塊法聯(lián)合培養(yǎng)所得的細胞,細胞表型免疫組化鑒定:波形蛋白、I型膠原表達陽性。(2)牙髓細胞在含地塞米松、?-甘油磷酸鈉和維生素C的條件培養(yǎng)基中可誘導分化為成牙本質細胞,形成鈣化結節(jié),堿性磷酸酶活性檢測升高,鈣化結節(jié)Von Kossa染色陽性表達。(3)利用基因芯片檢測了人DPCs及其誘導分化的成牙本質細胞miRNAs的表達譜,篩選了差異表達的miRNAs,礦化誘導的HDPC較未誘導HDPC的表達譜比較,有72種miRNA發(fā)生1.5倍以上表達上調,61種miRNA發(fā)生1.5倍以上表達下調。(4)對篩選出的差異表達miRNAs通過miRNA靶標預測工具分析發(fā)現(xiàn),帶有靶標基因的miRNA有35個,35個miRNA的靶標基因總和1327個,miRNA和靶標基因關系對總共2158個。(5)選擇hsa-miR-150用半定量RT-PCR進行驗證,結果與芯片結果一致。 結論(1)用組織塊酶消化法可從人牙髓中分離得到人牙髓細胞,并可在體外培養(yǎng)將其誘導分化為成牙本質細胞。(2)在人牙髓細胞及其誘導分化的成牙本質細胞中均存在大量的miRNAs。(3)在人牙髓細胞及其誘導分化的成牙本質細胞中存在差異表達的miRNAs,它們可能對牙髓細胞的成牙本質分化起著重要的調控作用,即存在所謂的特異性miRNA.
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R781.3
【圖文】：

系對。構建人所有的 miRNA 和它們調控的靶，取 4 個流行的 miRNA 靶標預測工具中的任意因存在靶標關系。針對每個GO和KEGG Pathw功能集中的數(shù)目，以及 136 個 miRNA 靶標基因子表， 計算富積得分，該富積得分就是比值比檢驗計算統(tǒng)計上顯著性程度 P 值，通過 BH（B來降低假陽性。組和未誘導組樣品中 hsa-miR-210 RT-PCR 產(chǎn)物 4-1），hsa-miR-210 在誘導前后均有表達，但表誘導分化組，說明 hsa-miR-210 在成牙本質細胞

通過 miRNA 靶標預測工具分析牙髓細胞組和礦化誘導成牙本質細胞組 1個表達有顯著性差異的 miRNA， 發(fā)現(xiàn)帶有靶標基因的 miRNA 有 35 個，35miRNA 的靶標基因總和 1327 個，miRNA 和靶標基因關系對總共 2158 個，針每個 GO 和 KEGG Pathway 計算 35 個 miRNA 靶標基因在該功能集中的數(shù)目，到差異 miRNA 的靶標基因體現(xiàn)的功能，主要集中在信號轉導，細胞增殖，轉調控等方面（圖 4-2A、B、C、D）。A B3.2 差異表達 miRNA 靶基因的預測及功能富積分析結果

【參考文獻】

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1 方廠云;曹瑩;夏宇;張雪梅;蘇征;李輝莉;;大鼠牙乳頭細胞與納米羥基磷灰石的體外復合培養(yǎng)[J];中南大學學報(醫(yī)學版);2007年01期

2 李昊妍;人牙髓細胞的體外培養(yǎng)[J];國外醫(yī)學.口腔醫(yī)學分冊;2004年02期

3 賀慧霞,金巖,史俊南,劉源,王亦菁,周澤淵,王新文;人牙髓干細胞的體外分離、培養(yǎng)及鑒定[J];臨床口腔醫(yī)學雜志;2004年09期

4 陳芳,殷勤偉;調控基因表達的miRNA[J];科學通報;2005年13期

5 張曉英,孫善珍;人牙髓干細胞向成牙本質細胞分化的誘導及鑒定[J];口腔醫(yī)學;2004年01期

本文編號：2731678