【摘要】：許多研究已經(jīng)證實抗菌劑在亞最低抑菌濃度（sub-minimal inhibitoryconcentrations, sub-MICs）下能夠抑制細菌生物膜的形成，然而，sub-MICs抗菌劑抑制生物膜形成的機制仍不清楚。目前，大部分的研究都集中于研究G-菌，而sub-MICs抗菌劑對G+菌的調(diào)節(jié)可能更復雜。變異鏈球菌(Streptococcus mutans, S. mutans,以下簡稱變鏈菌)是一種主要的致齲微生物。本研究測定了在洗必泰、茶多酚及氟化鈉三種常見抗菌劑1/2MICs濃度下處理后的變鏈菌生長曲線以及與變鏈菌形成生物膜相關(guān)的基因的相對表達量，并利用Bioflux系統(tǒng)形成一定流速狀態(tài)下的生物膜來觀察在剪切力作用下所形成的生物膜的形態(tài)特點。此外本研究還用場發(fā)射掃描電子顯微鏡（Field Emission Scanning Electron Microscopy, FE-SEM）及激光共聚焦顯微鏡（Confocal Laser Scanning Microscopy, CLSM）對變鏈菌的形態(tài)學改變進行了觀察和分析。 實驗結(jié)果顯示，這三種常見的抗菌劑均能夠明顯上調(diào)與變鏈菌生物膜形成相關(guān)的基因表達，而且經(jīng)過sub-MICs氟化鈉和洗必泰處理過的變鏈菌形成了具有大量細胞外基質(zhì)的致密生物膜。表明sub-MICs的抗菌劑能夠增強變鏈菌生物膜的形成，這可能不利于齲病的控制。 本實驗共分為五個部分 第一部分：抗菌劑對變異鏈球菌最小抑菌濃度（MIC）及最小殺菌濃度（MBC）測定 將氟化鈉、茶多酚、洗必泰、甲硝唑及青霉素五種抗菌劑粉劑分別按比例溶于無菌三蒸水中，過濾消毒。將凍存的變鏈菌菌株UA159復蘇，用二倍稀釋法測定這五種抗菌劑對變鏈菌的MIC，同時鋪板計數(shù)確定其MBC。結(jié)果顯示上述五種抗菌劑均對變鏈菌有一定的抑菌性，除了洗必泰的MIC和MBC一樣外，其余抗菌劑的MBC均比MIC高。 第二部分：Sub-MICs抗菌劑對變異鏈球菌生長曲線的影響 將1/2MICs的抗菌劑分別與變鏈菌制成混懸液，37℃恒溫厭氧培養(yǎng)，分別于0，2，4，6，8，10，12，24，48h取樣，用酶標儀測其OD600值，同時做活菌計數(shù)，用這兩組數(shù)據(jù)同時繪制生長曲線。結(jié)果顯示氟化鈉的抑菌性最強，青霉素和洗必泰次之，甲硝唑和茶多酚的作用最弱，接近對照組。 第三部分：Sub-MICs抗菌劑作用下變異鏈球菌生物膜相關(guān)基因的相對表達量分析 設(shè)計用于RT-PCR的引物。將實驗分為兩組，分別是浮游態(tài)組和生物膜組，將1/2MICs的各抗菌劑分別與變鏈菌一起37℃恒溫厭氧培養(yǎng)，浮游態(tài)組置于試管內(nèi)，生物膜組置于24孔板內(nèi)并在培養(yǎng)液中加入1%的蔗糖，24h后取樣，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄，RT-PCR測定相關(guān)基因的表達量。結(jié)果顯示幾乎所有的實驗基因均發(fā)生高表達。這說明sub-MICs的抗菌劑可促進生物膜相關(guān)基因的表達。 第四部分：Sub-MICs抗菌劑作用后變異鏈球菌的形態(tài)學改變的FE-SEM觀察 將健康離體牙切成2mm厚釉質(zhì)塊，75%酒精浸泡30min滅菌消毒。將1/2MICs抗菌劑分別與變鏈菌一起置于24孔板中，在培養(yǎng)液中加入1%的蔗糖，同時置入釉質(zhì)片，37℃恒溫厭氧培養(yǎng)，24h后取出釉質(zhì)塊，通過洗滌、固定、脫水、干燥以及噴金處理后，在FE-SEM下觀察變鏈菌的形態(tài)學變化，結(jié)果顯示，比起對照組，氟化鈉組和洗必泰組的變鏈菌表面的細胞外基質(zhì)增多，生物膜更致密，孔隙減少；而茶多酚組的變鏈菌表面只能看到堆積的細菌及極少數(shù)的細胞外基質(zhì)。提示氟化鈉和洗必泰可能促進了變鏈菌生物膜的形成，而茶多酚則可能通過抑制變鏈菌胞外基質(zhì)的合成，從而抑制了生物膜的形成。 第五部分： Sub-MICs抗菌劑作用下變異鏈球菌在Bioflux系統(tǒng)下形成生物膜形態(tài)的CLSM觀察 將1/2MIC的氟化鈉、洗必泰及茶多酚分別與一定量的變鏈菌菌懸液混合，并在混懸液中加入1%的蔗糖，然后將其分別置于BioFlux系統(tǒng)中在剪切力下培養(yǎng)15h后形成生物膜，用死/活菌熒光染料染色，CLSM下觀察。結(jié)果顯示對照組形成的生物膜內(nèi)部有大量的細胞空腔；而氟化鈉組和洗必泰組形成的生物膜只能看到極少量的水通道；茶多酚組無明顯的生物膜形成。這結(jié)果與第四部分的實驗結(jié)果相符合，均提示氟化鈉和洗必泰可能促進了變鏈菌生物膜的形成，而茶多酚則可能抑制了其形成。
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R780.2
【圖文】：

基因表型[21]。到目前為止，QS 系統(tǒng)在 G-菌研究的比較多，而對于 G+菌來說，則研究的相對較少。目前，對于變鏈菌種屬內(nèi)的密度感應(yīng)系統(tǒng)研究較多的是通過感受態(tài)刺激肽(competence stimulating peptide, CSP)介導的 QS 系統(tǒng)-ComAB/ComCDE 徑(圖 1)。CSP 信號分子是一種存在于多重基因路徑的效應(yīng)器，其中包括生物膜形成、細菌的耐酸性、細菌素的產(chǎn)生和細菌的毒力性等[22]。comAB 操縱子編碼的是 ComA 和 ComB 蛋白，其中 ComA 蛋白是一能夠與 ATP 相結(jié)合的傳輸體，而 ComB 蛋白則與 CSP 的加工及輸出有關(guān)comCDE 操縱子編碼的則是合成 CSP 的前體(ComC)、CSP 感受器(ComD)以及一個與 ComD 具有同源性的反應(yīng)調(diào)節(jié)子(ComE)。comX 基因編碼的是

2 95℃ 15 秒 PCR 循環(huán)中模× 3 60℃ 30 秒 退火4 68℃ 60 秒 延伸電泳成像儀下觀察到的變鏈菌生物膜形成相關(guān)基因普示。圖 2 中我們可以看到，從左到右分別是 Marker，16sComD，ComE，可以看出這幾條條帶都比較清楚，無引物相吻合，說明引物設(shè)計正確，退火溫度適合。

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 張耀超;于丹妮;;口腔致病菌在生物膜狀態(tài)和浮游態(tài)中的特性比較[J];國際口腔醫(yī)學雜志;2009年02期

2 梁景平;;牙菌斑生物膜特性研究進展[J];上海交通大學學報(醫(yī)學版);2007年02期

本文編號：2729926