【摘要】：背景和目的： 在前期的研究中,我們通過基因芯片技術(shù)從舌癌耐平陽霉素細(xì)胞株(Tca/PYM)中篩選到一個全新的耐藥相關(guān)新基因TCRP1,初步的功能研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)TCRP1基因的舌癌細(xì)胞對順鉑的耐受性顯著提高,提示TCRP1可能與順鉑耐藥有著密切的關(guān)系,但TCRP1在組織細(xì)胞中的表達(dá)及分布特性、介導(dǎo)順鉑耐藥的作用機(jī)制等均不明晰。因此,本研究擬通過生物信息學(xué)分析對TCRP1蛋白的理化性質(zhì)及其功能等進(jìn)行預(yù)測,制備抗TCRP1多克隆抗體,尋找能與TCRP1相互作用的蛋白并檢測其功能,最終達(dá)到從分子水平闡明該基因在舌癌耐藥中的作用機(jī)制,為實現(xiàn)舌癌化療敏感性預(yù)測及耐藥逆轉(zhuǎn)提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。 方法： 1.通過生物信息學(xué)的方法對TCRP1全長序列進(jìn)行預(yù)測分析,以獲得蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、抗原表位、亞細(xì)胞定位特性； 2.構(gòu)建pGEX-6P/TCRP1原核表達(dá)載體,表達(dá)、純化獲得具有生物學(xué)活性的TCRP1蛋白；免疫Balb/c小鼠獲得抗TCRP1多克隆抗體；用該抗體通過WB、IFA、IHC檢測TCRP1在各種腫瘤細(xì)胞株和舌癌組織中的表達(dá)及其亞細(xì)胞定位情況； 3.構(gòu)建TCRP1急定干擾細(xì)胞株,采用人毒理學(xué)和藥物抗性基因芯片(OHS-401)獲得耐藥基因TCRP1相關(guān)差異表達(dá)基因譜；實時定量PCR與WB法對基因芯片結(jié)果進(jìn)行驗證；對差異基因進(jìn)行G0聚類分析； 4.免疫共沉淀法尋找能與TCRP1直接結(jié)合的靶蛋白,再通過設(shè)計合成相應(yīng)siRNA干擾片段將其與TCRP1進(jìn)行沉默,MTS法、軟瓊脂集落形成和平板集落形成實驗檢測沉默后順鉑對舌癌耐藥細(xì)胞的影響,流式細(xì)胞術(shù)檢測沉默對耐藥細(xì)胞凋亡的影響,WB法檢測凋亡相關(guān)信號通路。 結(jié)果： 1.生物信息學(xué)分析提示舌癌耐藥相關(guān)基因(TCRP1),為一略偏堿性蛋白質(zhì),定位于11號染色體q13.4,包含有8個外顯子,其等電點PI為9.327,理論分子量約為25kDa,具有較強(qiáng)的抗原性,為胞內(nèi)表達(dá)蛋白,不存在跨膜區(qū)域同時也不會被細(xì)胞分泌出細(xì)胞外。 2.成功構(gòu)建pGEX-6P/TCRP1原核表達(dá)載體,通過正交設(shè)計得到TCRP1表達(dá)的最佳誘導(dǎo)條件并獲得有活性的重組TCRP1蛋白,該蛋白具有DNA保護(hù)作用,能拮抗由順鉑所導(dǎo)致的舌癌細(xì)胞DNA損傷,使其出現(xiàn)順鉑耐受現(xiàn)象；WB檢測發(fā)現(xiàn)TCRP1的表達(dá)并非腫瘤細(xì)胞特異性,而是順鉑耐藥特異性,即在耐順鉑的細(xì)胞中表達(dá)明顯高于其他細(xì)胞；IFA和IHC均顯示TCRP1主要表達(dá)于細(xì)胞胞漿。 3.成功建立TCRP1穩(wěn)定干擾細(xì)胞株,功能組基因芯片共發(fā)現(xiàn)了30個與耐藥細(xì)胞表達(dá)具有顯著差異的基因,其中上調(diào)基因9個,下調(diào)21個；采用G0功能分類分析發(fā)現(xiàn),在上調(diào)的基因中最多的是伴侶／熱休克蛋白類基因。而下調(diào)基因基因中,最多的為轉(zhuǎn)錄因子和調(diào)控分子類。 4.免疫沉淀結(jié)果提示MT1X和Akt能與TCRP1相結(jié)合,MT1X與TCRP1的表達(dá)水平呈正相關(guān),TCRP1能調(diào)控MT1X的表達(dá)。MTS、軟瓊脂集落形成實驗和平板克隆實驗發(fā)現(xiàn)沉默TCRP1和／或MT1X的表達(dá)能夠逆轉(zhuǎn)舌癌耐藥細(xì)胞對順鉑的耐受,流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)與對照組相比隨著TCRP1和MT1X被抑制后腫瘤細(xì)胞凋亡率逐漸升高,由對照組的8.04%分別上升到20.20%和,15.47%,聯(lián)合應(yīng)用MT1X和TCRP1干擾片段同時沉默TCRP1和MT1X的表達(dá)時,Tca/PYM細(xì)胞的凋亡率增加至37.48%,具有顯著性差異(P0.05)。 結(jié)論： 1.構(gòu)建了TCRP1基因原核表達(dá)載體,得到了高純度的TCRP1蛋白,并獲得了高效價的TCRP1多克隆抗體； 2. TCRP1蛋白主要定位于細(xì)胞胞漿,其在多種腫瘤細(xì)胞中均有表達(dá),但在對順鉑耐藥的細(xì)胞中的表達(dá)明顯上調(diào)； 3. TCRP1可通過影響凋亡相關(guān)基因的活性,促進(jìn)順鉑的代謝,加速順鉑向膜外轉(zhuǎn)運等方式介導(dǎo)舌癌細(xì)胞對順鉑的耐受； 4. MT1X和Akt能夠與TCRP1相結(jié)合,TCRP1通過上調(diào)MTX1表達(dá),增加MTX1螯合順鉑以減少其對DNA的損傷作用可能是TCRP1介導(dǎo)順鉑特異性耐受的主要途徑； 5.采用RNA干擾片段同時沉默TCRP1和MT1X基因的表達(dá),可通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡有效逆轉(zhuǎn)舌癌細(xì)胞對順鉑耐藥。
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R739.8

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 王升啟;基因芯片技術(shù)及應(yīng)用研究進(jìn)展[J];生物工程進(jìn)展;1999年04期

本文編號：2730119